多重数字PCR及其在疾病检测中的研究进展

曲 瑶，张皓博，刘蒙达，孙淑芳，亓 菲，孙翔翔，刘永夏，毛迎雪，李俊华，胡莉萍，樊晓旭

（1.中国动物卫生与流行病学中心，国家动物结核病参考实验室，山东青岛 266032；2.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271000；3.农业农村部反刍动物重大疫病防控重点实验室（东部），山东青岛 266032；4.农业农村部动物生物安全风险预警及防控重点实验室（南方），山东青岛 266032；5.沂源县畜牧渔业服务中心，山东沂源 256100；6.山东省动物疫病预防与控制中心，山东济南 250100）

1983年，美国生物化学家Kary Mullis发明了第一代PCR技术，并通过该技术实现了核酸的定性分析[1]；1993年，美国Applied Biosystems公司推出了第二代PCR技术，即荧光定量PCR技术（qPCR）[2]，实现了对PCR产物的实时定量，可作为半定量检测技术使用。不过这两种PCR技术都无法实现对核酸的绝对定量。20世纪90年代，数字PCR（digital PCR，dPCR）作为第三代PCR技术诞生了，其依靠微分隔离和逐一扩增单个DNA分子，实现了对核酸的绝对定量[3]。dPCR技术具有较高的灵敏度、准确性和可重复性，常被用于罕见突变、极低拷贝数分子检测以及核酸定量检测。

多重数字PCR（multiplex dPCR，mdPCR）是dPCR的衍生技术。相较于传统的dPCR，mdPCR可以同时分析多个靶序列。在多个样品中检测多个目标序列时，可以使用不同的荧光探针，并且每个荧光探针都可以经dPCR扩增后进行定量[4]。此外，与传统的多重PCR（multiplex PCR，mPCR）相比，mdPCR具有更高的灵敏度、更快速的检测速度和更好的准确性，在基因表达、病原体检测和癌症诊断等方面有广阔的应用前景。本文对dPCR和mdPCR的原理，mdPCR的优势与不足及其在疾病检测中的发展状况进行综述，以期为mdPCR的应用提供重要的理论指导。

1 原理

1.1 dPCR

dPCR是将核酸分子数稀释到一个反应体系中，使得每个微小反应仅包含0个或1个目标核酸分子，而分子数较少的样品可以被分成许多小反应，每个小反应中仅有少数分子，并用PCR技术扩增出来，从而实现高灵敏度检测[5]。

dPCR基本操作过程分为三步：分割、扩增和检测。首先，dPCR通过不同方式对反应体系进行稀释，将样本等分为大量的nL或pL级微反应单元，使每个微反应单元内包含少量或不包含目标核酸序列。接着，在每个微反应单元内进行独立的PCR扩增反应，与qPCR一样，dPCR也是利用亲和性荧光标记探针在PCR反应过程中产生的荧光信号来检测核酸[6]。在以往两代的PCR技术中，引物扩增效率会在很大程度上影响定量的结果，但就dPCR而言，对样本中目标核酸的定量结果并不受扩增效率影响。最后，检测每个小反应体系内的荧光信号，使用泊松分布，阳性分区微反应单元数量与总数的比值，可以确定样品中靶基因的绝对拷贝数。

尽管dPCR是基于微管或者微孔板开发的，但随着微流体技术的成熟，dPCR技术也有了很大提升[7]。目前，根据稀释方法的不同，dPCR平台主要分为两类，分别是微滴数字PCR（ddPCR）和微阵列芯片式数字PCR（cdPCR）。ddPCR是利用两种不互溶的流体，分别作为连续相（油）和分散相（水）反应，在两种流体的表面张力及剪切力的联合作用下，使分散相变成nL级的微小体积存在于连续相内，形成“油包水”的液滴[8]。cdPCR则是通过设计芯片，在芯片上分割有上万个相同体积的微孔方阵，在试验时可以将nL的液体封闭在高通量的微池中，再在独立的微反应单元中进行后续的PCR扩增[9]。相比之下，ddPCR拥有更好的准确度和置信度，因为它允许更大数量的重复，并且试验成本更低，但其稳定性和可控性相较于cdPCR略差[10]。而cdPCR虽然具有独立性更高的特点，但芯片加工难度大，且微反应单元的数量相对有限。dPCR工作流程示意图见图1。

图1 dPCR工作流程示意图[11]

1.2 mdPCR

mdPCR是在dPCR体系中，添加多个针对不同核酸序列的引物和探针，扩增出两个或两个以上核酸序列的dPCR反应。目前，mdPCR主要以两种方法实现：标记不同的荧光染料和改变荧光信号强度。

如果实验仪器配备有多种荧光通道，就可以分别使用不同的荧光信号标记引物探针，扩增不同的目标核酸，实现在结果中同时出现多个荧光微滴团[12]。当选用不同的引物探针标记同一目标核酸时，也可以通过荧光信号的叠加，使目的核酸的荧光微滴团与非目的核酸分离，在2D结果中呈现不同位置[13]。当实验仪器的荧光通道选择受限时，可以通过改变探针浓度实现对荧光信号值高低的调整，通过调整探针浓度，使不同的目的核酸在同一荧光通道中的位置分离，也可以实现mdPCR检测[14]。

除此之外，还可以基于cdPCR技术，通过改善芯片设计，在一个芯片上划分多个进样孔，在独立的微腔中进行PCR反应，从而在空间上实现多重检测[15]。由于单独使用多种荧光信号或调节荧光强度的方法效果有限，部分研究人员将两种方法相结合进行mdPCR检测[13]。

2 mdPCR的优势及不足

2.1 优势

作为一种新型核酸检测技术，dPCR虽然发展时间较短，但由于其具有高灵敏度、高准确度和高耐受性等优势，已成为重要的核酸检测方法，并显示出广阔的应用前景。特别是mdPCR，它不仅具备了单一dPCR灵敏度高、特异性强、准确性好等优点[13]，而且能够实现多个靶标的准确检测[16]，在同一PCR反应管中同时检测多个核酸片段或目的基因，节省了时间、耗材、样品和资金等，提高了检测效率和经济性。

相比mPCR、多重荧光定量PCR（mqPCR）、基因芯片和荧光微球等核酸检测方法，mdPCR在许多方面有着明显的优势。在灵敏度方面，mdPCR可以检测到极低数量级的DNA或RNA，可以准确检测低拷贝浓度样本，理论上可以检测到1个拷贝[17]。在特异性方面，mdPCR采用数字化技术，可以避免由于荧光信号交叉干扰而产生误差。在低靶基因浓度情况下依然可以保持高特异性[18]。在准确性方面，mdPCR不需要标准曲线，减少了假阳性和假阴性的产生，且其操作环节少，避免了试验环节污染导致的误差结果，具有高准确性[19]。在检测效率方面，mdPCR具有较快的反应速度，可以在较短时间内产生高质量的数据结果[20-21]。

虽然其他多重检测平台都有其独特的优势和应用场景，但mdPCR在灵敏度、动态范围、反应速度和数据量等方面表现更加卓越，在液体活检、肿瘤筛查、致病菌及病毒鉴别、多基因杂交、定量分析等方面的应用价值都很高。随着dPCR MIQE标准的提出[22]，dPCR程序、方案等得到了进一步规范，从而推进了mdPCR检测的长足发展。

2.2 不足

然而，mdPCR在实现高效率检测的同时，也增加了仪器成本。配备的多色荧光通道仪器价格相对较高。此外，为了避免荧光信号之间的频谱叠加，需要设计专用的软件来定义补偿矩阵，这进一步增加了仪器成本，并使反应体系的复杂性提高。mdPCR体系中，由于反应体系引物探针的选择及浓度的差异会涉及引物竞争性问题，因此引物探针、退火温度的多次优化是必不可少的[23]。在mdPCR中，引物的特异性对试验结果的影响尤为明显。因此，选择特异性更高的引物并优化其浓度，可以减少阴性液滴与阳性液滴之间的中间荧光强度液滴，是mdPCR的一个重要发展方向。

3 mdPCR在疾病检测中的应用

随着科学研究的发展，mdPCR在疾病检测领域得到了广泛应用，尤其在细菌与病毒检测、癌症检测和产前诊断等方面表现出了极大优势。

3.1 细菌检测

细菌性血流感染是威胁人类生命健康的重大问题之一，其主要病因之一是革兰氏阴性菌感染。随着细菌耐药性的逐渐增强，在病情初期选择适当药物治疗变得尤为关键。而传统的血液培养需要18～24 h，这会对抗生素的治疗效果带来不利影响。mdPCR技术很好地解决了这一问题，其不依赖于培养技术，可以在3 h内灵敏、特异地检测出大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等4种细菌的5个细菌特异性靶标和4个抗性基因，早期鉴定部分革兰氏阴性病原体的耐药性，从而为药物治疗提供更为准确的指导[24]。

在食源性细菌检测中，mdPCR技术也有广泛应用。肠出血性大肠杆菌（EHEC）是大肠杆菌的一种亚群，可导致众多严重疾病，如出血性腹泻、肾衰竭等。该病原体可经粪便、肉类等传播。对于EHEC，通常根据基因标记对其进行识别，如志贺毒素基因stx1或stx2、黏附素编码基因eae及特定血清群体的标记。然而，在较为复杂的食品样本中，含有eae基因的其他大肠杆菌可能对EHEC检测产生影响。为了提高食品中致病菌检测的准确性，研究人员设计了能够检测单个细菌中stx和eae基因的mdPCR方法，其在将完整细菌分散成液滴后，热裂解释放基因组DNA并进行mdPCR反应，然后根据同时扩增stx和eae目标基因的液滴比例（通常大于20%）与其他大肠杆菌混合物（通常小于2%）进行区分[25]。此外，有研究[26]还建立了食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌的mdPCR检测方法，实现了在同一体系内对3种常见食源性致病菌的特异、稳定检测。在菌株分类方面，有研究[27]利用副溶血弧菌的4个特征性靶基因tlh、tdh、ureR和orf8建立mdPCR方法，其不仅能实现对菌株的绝对定量，还能对单个细胞的副溶血弧菌进行血清型分类，节约了时间和成本。在鉴别诊断方面，与其他PCR方法相比，mdPCR在区分耐甲氧西林和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌方面也有着更优异的表现[28]。

在养殖环境检测方面，为了快速判断养殖粪污的无害化效果，确定粪污中有无危害动物生命健康的致病菌，利用mdPCR对肠炎沙门氏菌标记FAM荧光，对金黄色葡萄球菌标记HEX荧光，对大肠埃希氏菌标记CY5荧光，通过对荧光信号的分离，实现对肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌进行快速、准确鉴定[29]。在大规模人工养殖鲑鱼时，为准确评估水样中病原体的水平，有研究[30]建立了一种针对鲑鱼常见病原体鲁氏耶尔森氏菌和嗜冷黄杆菌的mdPCR方法，可分别检测鲁氏耶尔森氏菌和嗜冷黄杆菌的4个亚种。

3.2 病毒检测

mdPCR技术能够提高病毒检测的灵敏度和特异性，有望在病毒疾病的诊断、治疗和疫情监测方面发挥更大作用。

在疫苗生产过程中，通常使用单独的血清型特异性逆转录qPCR（RT-qPCR）来检测黄热病-登革热（CYD）嵌合疫苗病毒（CYD1、CYD2、CYD3和CYD4）的RNA。目前，已有研究[31]建立了RT-mdPCR方法，在一次检测中定量4种CYD血清型的RNA。研究人员将CYD1和CYD2标记FAM荧光，CYD3标记YY荧光，CYD4同时标记FAM和YY荧光，结果发现每个CYD RNA的集群位置与模型预测的一致，且与血清型特异性RT-qPCR的样品定量结果相似，实现了多重检测。

在艾滋病病毒（HIV）感染治疗结束后，机体内潜伏的一小部分具有复制能力的完整前病毒会重新开始复制，阻碍患者的康复。因此，准确评估和量化这些前病毒对于完全消除前病毒（HIV-1）至关重要。mdPCR在检测HIV潜伏感染方面具有明显优势。有研究[32]对HIV-1主要结构蛋白PSI、ENV、GAG和病毒特异性酶POL进行研究，首先对PSI标记FAM荧光，对ENV标记HEX荧光，对GAG和POL标记CY5荧光，然后利用mdPCR实现了对PSI、ENV、GAG/POL的定量分析，从而实现了对HIV-1的更准确、高效检测，同时表现出mdPCR在HIV-1潜伏感染分析中的潜力。

在近几年新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染和流感流行的大背景下，mdPCR凭借其独特的优势而日益受到关注。由于SARS-CoV-2基因组会发生突变从而导致假阴性结果出现，有研究[33]建立了一种RT-mdPCR检测方法，可同时检测SARSCoV-2的基因N（N1+N2）、E和RdRp及患者管家基因的mRNA，有效降低了假阴性结果出现概率，有助于SARS-CoV-2与其他冠状病毒感染的鉴别诊断。2021年，江苏省颁布了dPCR诊断SARS-CoV-2感染的地方标准，发现通过对ORF1a/1b基因和N基因的拷贝数测定，能够有效诊断SARS-CoV-2感染[34]。在甲型和乙型流感诊断方面，有研究[35]开发了RT-mdPCR方法，其可以鉴别甲型流感病毒H1、H3、M型，乙型流感病毒HA、HA和M型感染以及两者的混合感染。这些方法为临床诊断和实验室研究提供了一种强有力的工具。

2021年国内开发了能够同时检测非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）的mdPCR试剂盒，在低病原浓度情况下，也可以对其实现高特异、高敏感的诊断，从而有助于更准确、高效、经济地防控这3种严重危害养猪业的疫病[36]。在ASFV、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的鉴别检测方面，研究[37]建立的mdPCR的检出限为0.469 copies/μL，灵敏度比qRT-PCR高10倍，表明此方法对于临床生产中的上述病原的鉴别检测与混合感染检测具有较高的应用价值。

3.3 癌症检测

mdPCR具有高灵敏度和特异性，可以同时检测多个与癌症相关的基因突变情况，在癌症的临床诊断和治疗中有很大的应用前景。在非小细胞肺癌晚期患者中，表皮生长因子受体（EGFR）的致敏和耐药突变检测，对于EGFR酪氨酸激酶抑制剂的选择及癌症治疗具有重要意义。EGFR酪氨酸激酶抑制致敏突变预示癌变的发生，通过对患者细胞游离DNA的EGFR酪氨酸激酶的5个抑制致敏突变位点Ex19Del、L858R、L861Q、G719S和S768I进行筛查，建立mdPCR方法，确认突变位点。阳性患者在治疗期间接受了以致敏突变位点以及T790M和C797S耐药位点建立的mdPCR，来监测癌症和耐药。进一步对患者血液中的游离DNA进行定量，根据游离DNA的浓度和丰度分数进行分析，及时更改治疗方案。mdPCR检测结果能很好地反映疾病进程，表明mdPCR可能是非小细胞肺癌患者治疗监测中的一种有价值的诊断工具[38]。

BRCA1基因发生重排和体细胞重排在乳腺癌和卵巢癌的发生中起重要作用，临床上监测BRCA1重排的方法主要是MPLA。随着对灵敏度、特异性和经济成本要求的不断提高，mdPCR也被应用于乳腺癌和卵巢癌的临床筛查。研究[39]表明，利用3个BRCA1外显子和1个参比基因（ALB或RPP30）建立的4重mdPCR方法，与商业化MPLA试剂盒的一致性为100%，而且在检测BRCA1重排方面更加简单和精确。

3.4 产前诊断

mdPCR可以同时高灵敏地检测多个与胎儿遗传病相关的基因，实现妊娠早期对胎儿进行可靠的染色体异常筛查，帮助提前诊断和预防胎儿遗传病。

唐氏综合征是一种常见的染色体异常病。mdPCR技术可以同时检测染色体中与唐氏综合征相关的基因的拷贝数变化，包括21号、18号和13号染色体，从而实现对唐氏综合征的早期筛查和预测。研究[40]表明，从60个孕妇血浆样品中提取细胞游离DNA并进行产前筛查，mdPCR检测结果的准确率为100%，实现了高精度诊断唐氏综合征。

在新生儿脊髓性肌萎缩症的筛查中，有研究[41]成功建立了一种mdPCR检测方法。脊髓性肌萎缩症常常由SMN1外显子7缺失，5qSMN1旁系同源物和SMN2的尿苷拷贝数变化导致，因此通过检测SMN1外显子7、SMN2和RPP303个基因，能够高效、准确地诊断新生儿的脊髓性肌萎缩症，并且与T细胞切除环测定法结合使用，可用于治疗严重联合免疫缺陷。

4 展望

随着仪器设备及试验耗材成本的降低，mdPCR在高精度和高灵敏度的核酸检测方面，有着广泛的应用前景。在未来，mdPCR可能会被广泛应用于临床实践，帮助早期发现多种疾病，如肿瘤、心血管疾病和自身疾病等。mdPCR还可以精准诊断不同个体之间的基因差异，从而实现个性化医疗。在生命科学领域，mdPCR有望成为生命科学研究中不可或缺的工具，如在适应症药品研究、病原检测和基因表达的绝对定量等方面。在动物疾病筛查方面，mdPCR对疾病初期和隐性感染具有优秀的诊断能力，如对动物结核病的早期诊断和潜伏感染筛查，有助于种群结核病净化，维护公共卫生安全。在动物遗传育种方面，mdPCR对筛查遗传疾病有着巨大的潜力，可检测动物体内存在的基因突变或变异，在保护濒危动物、种群多样性、培育优良动物品种等方面都有广阔前景。在动物生物制品方面，mdPCR有望成为动物疫苗研发过程中不可或缺的工具，通过检测和监测载体、辅助剂和抗原的存在和浓度，对疫苗进行动态监测，以确保疫苗质量和批次间的稳定性。随着技术的进一步发展，mdPCR将为人类和动物疫病检测提供技术支撑，为人类和动物的健康福祉做出更大贡献。

然而，mdPCR目前在国内还相对较新，仍然存在需要突破的难题：（1）样本处理和纯化。mdPCR的高灵敏度和高精度对样本处理和纯化的要求更高，现有的方法并不完美，因此需要开发新的样本处理和纯化方法，以提高技术的可靠性和灵敏度。（2）技术自动化。mdPCR需要较长的试验时间，大量的操作和高级别实验员。未来需要开发自动化dPCR设备和操作流程，将技术的可操作性提高到更高水平。（3）数据分析和计算。dPCR产生了大量的数据，需要有效的数据分析和计算方法，并开发方便、易用的软件程序来进行数据解读和分析。（4）降低成本。当前mdPCR的成本相对较高，需要进一步探索新的技术路线、材料、设备和流程等，以降低mdPCR的成本，实现大规模、快速、经济的应用。总之，mdPCR在未来需要不断发展和完善，以满足更加广泛的需要和成为更多领域的重要技术。