金钱鱼毒腺基因NeoVTX的基因序列和表达

曾 珍，卢嘉仪，江东能，李广丽，樊 森，黄远青，施 钢

（广东海洋大学 水产学院，广东 湛江 524088）

0 引言

长期以来，动物毒液一直被认为是发现新生物活性分子的极好资源，多数毒液由大量的酶和小肽等重要蛋白质生物活性成分组成。尽管有2 000多种有毒鱼类，但目前鱼类毒腺研究较少[1］。大多数毒腺研究采用整个或部分分离的毒液，揭示其药理作用，包括心血管、神经肌肉、细胞毒性、炎症和伤害性活性。也有研究从鲉形目鱼类中已分离出几种大型蛋白质类毒素，如Stonustoxin（SNTX，粗毒鲉），Verrucotoxin（VTX，玫瑰毒鲉）和Sp-CTx（Scorpaena plumieri）[1-2］。在玫瑰毒鲉中发现的Neoverrucotoxin（NeoVTX）是一种由α亚基（702 个氨基酸残基）和β亚基（699 个氨基酸残基）组成的蛋白类毒素[3］346，[4］。该毒素（NeoVTX）的α、β亚基与SNTX的α、β亚基的氨基酸序列同源性分别高达87%和95%[3］346，[4］。NeoVTX的β亚基与VTX的β亚基的同源性为90%[3］346。NeoVTX具有溶血活性和致死性，对小鼠的半数致死量（LD50）为47 ng·g-1（静脉注射）[3］346。

金钱鱼（Scatophagus argus）商品名为金鼓鱼，属于辐鳍鱼纲（Actinopterygii）鲈形目（Perciformes）金钱鱼科（Scatophagidae）金钱鱼属，主要生活在印度洋、太平洋海域，是广盐性亚热带硬骨鱼[5］，在我国南海及北部湾均有分布。金钱鱼是一种具有观赏和食用价值的名贵海水经济鱼类，也是海洋主要刺毒鱼之一，其毒性部位包括11 根背鳍棘、一对腹鳍棘和4 根臀鳍棘，各鳍棘两侧均分布有发达毒腺组织的侧沟，毒性较强[6-7］。当刺毒鱼受到攻击时，毒鳍棘会刺入对方体内，同时将毒液从毒腺组织里挤出，注入对方体内，引起一系列中毒症状。金钱鱼毒性发作一般出现在5～10 min 内，进入人体血液后，表现为剧烈和持续的局部疼痛、麻痹，随后出现红斑、水肿，并延伸至四肢，进而出现头晕[8］914。国内对金钱鱼毒腺研究很少，主要停留在病例报告上，目前仅有一篇关于金钱鱼毒腺cDNA表达文库的构建及EST序列分析的文献[7］。为了更多了解金钱鱼毒液成分，本文通过从金钱鱼基因组中分离NeoVTX（α和β亚基）基因序列，研究NeoVTX α亚基（NeoVTX-α）和NeoVTX β亚基（NeoVTX-β）基因在金钱鱼不同组织中的表达，并分析其物理化学性质和结构特征，旨在了解金钱鱼NeoVTX基因序列和结构，为进一步研究金钱鱼毒素基因提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用金钱鱼来源于广东海洋大学东海岛基地。毒腺组织提取参照Sivana 等[8］915的实验方法，麻醉活金钱鱼后，剪切其背部毒刺约5 g，液氮中充分研磨，待液氮挥发完全后用于提取毒腺RNA。同时解剖取下丘脑（Hy）、垂体（Pi）、肝脏（Li）、头肾（HK）、脾脏（Sp）、性腺（Go）、尾鳍（Fi）、皮肤（Sk）等组织，将其放入液氮速冻，然后转移至-80 ℃保存，用于提取各组织总RNA，进行基因表达分析等。

1.2 提取总RNA 和反转录合成cDNA

按照Trizol 试剂盒（Invitrogen，15596108，美国）说明书提取毒腺等组织总RNA[9］。取1 μL 总RNA，采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA 质量。另取1 μL RNA，利用Nanodrop 2000 超微量核酸蛋白测定仪（Thermo Scientific，美国）测定RNA浓度，其余总RNA置于-80 ℃保存，备用。

分别取1 μg 金钱鱼毒腺等组织样品的总RNA，按照PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒（TaKaRa ，RR047A，日本）说明书反转录合成cDNA。

1.3 金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β基因序列分析

在实验室构建的金钱鱼全基因组数据库中进行比对分析，分离了金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β基因序列。利用NCBI 网在线预测金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β的开放阅读框（ORF）。使用在线软件pI/Mw测定NeoVTX-α和NeoVTX-β蛋白质等电点及分子质量等基本物理化学性质。利用SignalP 4.1 软件预测NeoVTX-α和NeoVTX-βN 末端的信号肽。利用SWISS-MODEL 同源建模的方法对NeoVTX-α和NeoVTX-β的三级结构进行预测。

1.4 基因系统进化分析

从NCBI数据库中下载不同物种NeoVTX-α和NeoVTX-β基因序列，包括：荫平鲉（Sebastes umbrosus）、玫瑰毒鲉（Synanceia verrucosa）、粗毒鲉（Synanceiahorrida）、尖头拟鲉（Scorpaenopsisoxycephala）、大黄鱼（Larimichthyscrocea）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、南方蓝鳍金枪鱼（Thunnus maccoyii）、斑马鱼（Danio rerio）和非洲爪蟾（Xenopus laevis）等。利用Lasergene 7.1.0 软件包进行蛋白质序列多重比对和同源性分析。利用MEGA 7.0软件，使用邻接方法，重复检测500次，构建系统发育树[10］。

1.5 实时荧光定量PCR（qPCR）检测

采用NBCI 在线设计qPCR 引物（表1），以β-actin为内参基因，使用实时荧光定量PCR 仪（Roche，瑞士）检测金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β在不同组织中的表达。qPCR 根据试剂盒说明书进行，反应体系20 μL，其中正反引物均为0.8 μL；cDNA 模板为2 μL，TakaRa TB GreenⅡ为10 μL，无菌水为6.4 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃模板变性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40 个循环；72 ℃延伸10 min，最后采集熔解曲线。基因相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。

表1 本实验所用引物

1.6 金钱鱼各组织转录组测序

将提取的金钱鱼毒腺总RNA 交送给广州基迪奥生物科技有限公司进行转录组测序，将测序结果进行分析，计算基因相对表达量。并收集本实验室已经测定的金钱鱼下丘脑、垂体、肝脏、头肾、脾脏、性腺、尾鳍、皮肤等组织的转录组测序数据，分析基因相对表达量。

2 结果与分析

2.1 金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β的物理化学性质

在线软件pI/Mw 测定结果发现，金钱鱼NeoVTX-α蛋白相对分子质量为59 029.45。在20种氨基酸中，亮氨酸（Leu）的含量较高（9.16%），色氨酸（Trp）和组氨酸（His）的含量最低（0.76%），蛋白质等电点（pI）为5.85，不稳定系数为45.25，脂肪系数为84.26，总平均亲水性为-0.306。金钱鱼NeoVTX-β蛋白相对分子质量为78 862.19。在20 种氨基酸中，亮氨酸（Leu）的含量较高（10.41%），组氨酸（His）的含量最低（1.14%），蛋白质等电点（pI）为5.09，不稳定系数为40.58，脂肪系数为83.01，总平均亲水性为-0.39。以上表明，该蛋白属于不稳定蛋白质。

金钱鱼NeoVTX蛋白的信号肽序列预测结果显示，NeoVTX-α和NeoVTX-β不存在信号肽，这与鲈形目的褐蓝子鱼（Sp-CTx）、鲉形目中粗毒鲉（SNTX）等毒腺蛋白信号肽预测结果一致[11］。

2.2 金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β同源性及系统进化树分析

金钱鱼NeoVTX-α同源性分析结果（表2）显示，在硬骨鱼类中，金钱鱼与荫平鲉同源性最高（73.5%）；其次，与尖头拟鲉、玫瑰毒鲉、粗毒鲉、南方蓝鳍金枪鱼、大黄鱼和尼罗罗非鱼同源性分别为72.3%，69.6%，67.3%，54.4%，53.1%和48.8%；而与斑马鱼的同源性较低（37.4%）；与两栖类非洲爪蟾同源性也较低（39.1%）；在哺乳类人和鼠中未找到NeoVTX-α。金钱鱼NeoVTX-β同源性分析结果（表2）显示，在硬骨鱼类中，金钱鱼与大黄鱼同源性最高（65.4%）；其次，与南方蓝鳍金枪鱼、荫平鲉、尼罗罗非鱼、尖头拟鲉、玫瑰毒鲉和粗毒鲉同源性分别为 64.1%，61.9%，55.8%，49.7%，47.6% 和 46.6%；而与斑马鱼的同源性较低（39.1%）；与两栖类非洲爪蟾同源性也较低（39.1%）；在哺乳类人和鼠中未找到NeoVTX-β。

表2 金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β与其他物种氨基酸序列的同源性分析单位：%

系统进化树与序列同源性分析结果相一致。金钱鱼NeoVTX-α与鲉形目的荫平鲉、尖头拟鲉、玫瑰毒鲉、粗毒鲉等同属一个分支，且具有较高同源性，与另一分支同为鲈形目的南方蓝鳍金枪鱼、大黄鱼和尼罗罗非鱼同源性较低，而与另一分支斑马鱼和非洲爪蟾同源性最低[图1（a）］。金钱鱼NeoVTX-β与同为鲈形目的大黄鱼、南方蓝鳍金枪鱼和尼罗罗非鱼等同属一个分支，且具有较高同源性，与另一分支鲉形目的尖头拟鲉、玫瑰毒鲉、粗毒鲉等同源性较低，而与另一分支斑马鱼和非洲爪蟾同源性最低[图1（b）］。

图1 金钱鱼NeoVTX-α（a）和NeoVTX-β（b）的系统发育进化树

2.3 金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β 结构预测

金钱鱼NeoVTX-α的开放阅读框（ORF）长度为1 581 bp，共编码526 个氨基酸。金钱鱼NeoVTX-β的ORF长度为2 106 bp，共编码701个氨基酸。将金钱鱼NeoVTX转录组基因与基因组进行比对，发现金钱鱼NeoVTX-α由2 个外显子编码，外显子1 和2 长度分别为92 bp 和1 489 bp，内含子1 为920 bp。金钱鱼NeoVTX-β由3个外显子编码，外显子1、2、3长度分别为92 bp、1 462 bp和552 bp，内含子1和2分为1 363 bp和115 bp（图2）。

图2 金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β的基因结构

一般而言，若序列经比对（Alignment）后的序列同源性（Sequence identity）在40%（也有认为35%）以上，则它们的结构可能属于同一家族，认为它们是同源蛋白（Homology），可用同源蛋白模型构建的方法预测其三维结构[12］。因为它们可能是由同一种蛋白质分化而来，才具有相似的空间结构，有相同或相近的功能。因此，若知道同源蛋白家族中某些蛋白质的结构，就可以预测其他结构未知的同源蛋白结构。通过X 射线晶体学获得的粗毒鲉毒素蛋白SNTX 三维结构（PDB：4WVMA 和4WVMB，SNTX-α和SNTX-β）是目前少数已知三维结构的毒素之一。金钱鱼毒腺NeoVTX-α和NeoVTX-β蛋白质的序列与粗毒鲉SNTX-α和SNTX-β的序列同源性分别为67.3%和46.12%，均大于40%。本研究选择SNTX 作为比对模板，利用同源建模的方法对NeoVTX-α和NeoVTX-β的三级结构进行预测并构建模型，其中有GMQE（Global model quality estimation，全球模型质量估计）和QMEAN（Qualitative model energy analysis，定性模型能量分析）两个模型构建质量评估指标。GMQE 是一种结合目标-模板对齐方式和模板搜索方法属性的质量估计，GMQE 值可信度范围为0～1，越靠近1，构建的模型越好。QMEAN 值区间为-4.0～0，越接近0，构建的模型越成功，而分数小于或等于-4.0，构建模型不可靠[13］。

金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β的预测结构见图3，其中NeoVTX-α的GMQE 值为0.79，QMEAN 值为0.76±0.05；NeoVTX-β的GMQE 值为0.75，QMEAN 值为0.73±0.05。预测结果表明，金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β三维结构质量较好、可信度较高，与SNTX三维结构比较相似。

图3 金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β与粗毒鲉SNTX的三维结构

2.4 金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β在不同组织中的表达

实时荧光定量PCR 结果显示，金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β均在毒腺（To）组织中表达最高，在性腺（Go）组织中表达较低，在毒腺组织的表达量约为在性腺表达量的30倍，在其他组织几乎不表达（图4）。金钱鱼毒腺转录组和其他组织转录组分析结果（图4）显示，金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β在不同组织中的表达与qPCR 结果基本一致。结果表明，NeoVTX-α和NeoVTX-β在毒腺组织中表达最高，在其他组织中几乎不表达。

图4 金钱鱼NeoVTX-α（a）和NeoVTX-β（b）mRNA在不同组织中的表达

3 讨论

Sivana 等[8］914的研究表明，从金钱鱼背部毒刺提取出来的粗毒液可以诱导小鼠血清肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）快速升高，显示出毒液的肌毒性。毒液成分分析显示，毒液存在磷酸二酯酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、蛋白酶和溶血蛋白活性。金钱鱼的粗毒液提取物具有多种生物活性，如小鼠致死、溶血、水肿和伤害活性，与Scorpaeniform 和Fuscescens等鲉形目鱼类毒素相类似[14-15］。本文按照Sivana等[8］914的试验方法提取出金钱鱼的粗毒液，并提取总RNA，进行NeoVTX-α和NeoVTX-β基因表达分析。

有研究表明[3］345，[4］，鲉形目中石头鱼（粗毒鲉和玫瑰毒鲉）是世界上毒性最强的鱼之一，在鲉形目的鱼类研究中发现了很多鱼类关键毒素，如在粗毒鲉中发现了毒素Stonustoxin（SNTX），在玫瑰毒鲉中发现了毒素Neoverrucotoxin（NeoVTX）和Verrucotoxin（VTX），在尖头拟鲉中发现了毒素S.oxycephala toxin（SoTx），鲉形目是比较有代表性的毒性鱼类。本研究中，根据邻位相连法构建的NeoVTX-α系统进化树和氨基酸序列同源性分析结果显示，金钱鱼NeoVTX-α与鲉形目的荫平鲉、尖头拟鲉、玫瑰毒鲉、粗毒鲉等鱼类同属一支且同源性较高（67.3%～73.5%），而与同为鲈形目的南方蓝鳍金枪鱼、大黄鱼和尼罗罗非鱼等鱼类不属同一支且同源性较低。结果表明，鲈形目的金钱鱼NeoVTX-α与有毒的鲉形目鱼类更接近，同源性更高，而与同为鲈形目的无毒鱼类同源性更低，可以推测金钱鱼NeoVTX-α与鲉形目鱼类同属一支且同源性较高，是一种与鲉形目鱼类毒素相似的关键毒素。

毒素Stonustoxin（SNTX）包含α和β亚基，氨基酸残基分别为703与700个，晶体结构呈四角形[16］，是目前少数研究分析出其三维结构的毒素，常作为其他毒素结构的模板。有研究表明，SNTX毒素具有抑制神经肌肉接头功能、强烈的溶血作用、促进血小板凝集、增强血管通透性、引发水肿等多种生物活性，对小鼠的半数致死量（LD50）为 17 ng·g-1（静脉注射）[17］。金钱鱼NeoVTX蛋白的信号肽序列预测结果显示，NeoVTX-α和NeoVTX-β不存在信号肽，这与鲉形目的粗毒鲉和鲈形目的褐蓝子鱼（Siganus fuscessens）等毒腺蛋白信号肽结果一致[11］。同时，利用SWISS-MODEL 预测金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β三级结构发现，金钱鱼的NeoVTX-α和NeoVTX-β三级结构与SNTX相似，其中：NeoVTX-αGMQE 值为0.79，QMEAN 值为0.76±0.05，NeoVTX-βGMQE值为0.75，QMEAN 值为0.73±0.05，结构预测结果可靠。研究结果表明，金钱鱼NeoVTX的结构与毒素SNTX非常相似。由金钱鱼NeoVTX和粗毒鲉SNTX之间结构的相似性可以推断，金钱鱼NeoVTX可能是一种与粗毒鲉SNTX性质相似的毒素。

qPCR 实验结果和转录组数据表明，金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β在毒腺组织中高表达，在其他组织中不表达或低表达，说明金钱鱼NeoVTX基因可能是一种毒素基因。综上所述，可以推测金钱鱼NeoVTX可能是一种与鲉形目毒素相类似的毒素。

4 结论

金钱鱼是我国东南沿海一种名贵海水经济鱼类，具有极强的环境适应性和抗病抗逆性。金钱鱼不仅具有观赏价值，而且具有很高的食用价值，也是海洋主要刺毒鱼之一。本文从基因组分离了金钱鱼NeoVTX-α和NeoVTX-β，并分析了其表达模式。金钱鱼NeoVTX与常见的毒腺蛋白信号肽结果一致，均不含信号肽。同时，同源性分析表明，金钱鱼NeoVTX-α与有毒鱼类（鲉形目）同属一支且同源性较高，其三级结构与毒素SNTX结构相似。另外，金钱鱼NeoVTXmRNA 在毒腺组织中高表达，其他组织不表达或低表达。因此，可以推测金钱鱼NeoVTX可能是一种与鲉形目毒素相类似的毒素。这对研究金钱鱼毒素成分及功能具有一定参考价值。