蓝光致棕色挪威大鼠慢性视网膜光损伤的实验研究

2023-11-07俞永珍程天豪邹秀兰章梦一余洋洋邹玉平庞龙

天津药学 2023年5期

俞永珍，程天豪，邹秀兰，章梦一，余洋洋，邹玉平，3，庞龙

湿性年龄相关性黄斑变性（wet age related macular degeneration，wAMD）是中老年最常见的致盲性眼病［1］，其中眼底色素沉积与wAMD 的发生发展密切相关，提示黑色素在wAMD 的发病机制中极为重要［2-3］。近年来研究显示，慢性光损伤是导致wAMD、视网膜色素变性及其他视网膜变性类眼病的高危因素［4］，而研究光感受器细胞及视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium cell，RPEc）的损伤机制，有助于明确该类疾病的病理发生机制。蓝光在可见光中波长较短，光能量大，穿透性强，故蓝光最容易穿透角膜和晶状体到达眼底视网膜，造成视网膜损伤［5］。棕色挪威（Brown Norway，BN）大鼠是有色鼠，因视网膜和色素成分与人体类似，RPEc及脉络膜组织中含有大量的黑色素，且RPEc层和脉络膜毛细血管复合体层也与人体类似［3，6］。目前鲜有有色鼠的光损伤相关研究。笔者推测蓝光诱导的BN 大鼠视网膜光损伤可能发生了类似wAMD 的病理过程，通过建立蓝光诱导的慢性视网膜光损伤动物模型，旨在研究蓝光照射BN大鼠后光感受器细胞及RPEc的损伤特点及可能损伤机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40 只雄性成年BN 大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2021-0011，体质量180～200 g，8周龄。在通风良好，氨浓度≤14 mg/m3，相对湿度40%～70%，12 h明/暗的循环光环境中适应2周，光照前暗适应24 h，环境温度18～22 ℃。根据随机数字表法分为光照0 d组（正常对照组）和蓝光光照组：光照1、3、7及14 d组，每组8只。本研究经中国人民解放军南部战区总医院实验动物伦理委员会批准同意，批准号：SYOW2022023，实验过程中按照动物使用的“3R”原则给予人道主义关怀。

1.2 试剂与仪器苏木素染色液、苏木素分化液、苏木素返蓝液（武汉塞维尔生物有限公司），中性树胶（国药集团化学试剂有限公司）；大鼠活性氧簇（ROS）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（美国Rapidbio 公司），FL-1D 蓝光辐照计（北京师范大学光电仪器厂）；LED 蓝光光源（主波峰451 nm，色纯度0.982，中山共炫光电科技有限公司）；Topcon眼底照相机（德国Topcon 公司）；电生理仪、Ganzfeld 刺激器（德国罗兰公司）；金属环状角膜接触电极、金属针状接触电极（北京高视远望科技有限责任公司）；BX-51 显微镜（日本Olympus 公司），Multiskan Go 酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 LED 蓝光光照箱制备按照大鼠饲养箱规格用亚克力板制作大鼠蓝光光照箱，并分隔为4格；光源用LED蓝光灯，保证光照箱的蓝光光照强度平均在（1 000±100）Lux，蓝光灯的灯板规格为460 mm×300 mm，4 个角区域留出10 mm×10 mm 的面积，以利于光照箱内空气流通，光照时将蓝光灯朝向内部并将灯板置于大鼠饲养箱的顶部，见图1。光照时保持光照箱内温度为28～32 ℃。

Fig.1 Home-made LED blue light animal light incubator图1 自制LED蓝光冷光源动物光照箱

1.4 处理方法正常对照组大鼠不进行光照，正常饲养；余各组大鼠均于光照前20 min 给予复方托吡卡胺滴眼液（1 mL/支，沈阳兴齐眼药股份有限公司）散瞳处理，每次1滴，每次间隔5 min，共滴4 次；蓝光光照组大鼠每日处于蓝光光照环境中3 h，分别照射1、3、7、14 d。光照结束后将大鼠送回暗环境中，给予氯霉素滴眼液滴眼，每次1 滴，每次间隔5 min，滴2次。观察各组大鼠的行为表现，包括毛发色泽、精神状况、食欲、体质量、对光声的刺激反应。

1.5 视网膜电流图（electroretinogram，ERG）检查 ERG检查所有操作在暗室内微弱红光灯下进行，采用电生理仪记录大鼠双眼ERG信号。BN大鼠暗适应6 h后，行10%水合氯醛腹腔注射麻醉，复方托吡卡胺滴眼液点双眼散瞳，0.4%盐酸奥布卡因滴眼液（20 mL/支，日本参天制药株式会社）点双眼表面麻醉。将金属环状角膜接触电极安放在检测眼的角膜上，尽量使电极与角膜最大接触，将金属针状电极（参考电极及接地电极）分别插在脸颊两侧和尾部皮下。电生理仪Ganzfeld闪光刺激器提供闪光，闪光强度：3.0 cd·s/m2，背景光强度25 cd·s/m2，每个点至少测量3次，采用双通道同步采样记录，通频带0.2～500 Hz，每项记录重复30 次。记录最大混合反应ERG的a、b波振幅和潜伏期，a波振幅为基线到a波波谷的电位值，a波潜伏期为从光刺激开始至a波波峰的时间；b波振幅为a波波谷至b波波峰的电位值，b波潜伏期为从光刺激开始至b波波峰的时间。

1.6 眼底照相大鼠完成ERG检查后，保持瞳孔散大状态，必要时酌情行10%水合氯醛腹腔注射麻醉。用眼底照相机采集BN大鼠以视盘为中心的50°范围的眼底彩照。

1.7 视网膜组织HE 染色将大鼠行10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，脊椎脱臼法处死大鼠，随后立即摘除双侧眼球，制备石蜡切片，切片厚度4 μm，将切片经二甲苯脱蜡后，依次进行苏木素染色、分化、返蓝、伊红染色、透明及封片。BX-51显微镜下观察视网膜组织切片染色情况，Image-J 软件测量外层视网膜厚度，即光感细胞层至外核层的视网膜厚度。

1.8 ELISA 检测视网膜组织ROS 含量将新鲜摘除的大鼠眼球组织置于冰上，小心去除眼前节组织并分离出视网膜组织。取100 mg 视网膜组织，加入1 mL 生理盐水，于4 ℃下3 000 r/min 离心10 min，取上清液，置于1.5 mL 离心管中，-20 ℃保存。按照ELISA检测试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪测定视网膜组织ROS含量。

1.9 统计学方法采用SPSS 27.0软件进行数据分析。计量资料均符合正态分布，以表示，多组间比较采用单因素方差分析，均经Levene 检验行方差齐性检验，方差不齐时用Dunnett-T3 检验进行组间多重比较，方差齐时用LSD-t检验进行组间多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蓝光照射对大鼠的行为活动影响正常对照组饲养期间精神状态良好，毛发有光泽，行动、饮食正常；与正常对照组比较，光照1 d组及光照3 d组在体形、饮食及精神状态上无明显差异，但光照3 d 组对光声刺激的反应迟钝；光照7 d及14 d组精神较萎靡，毛发光泽度降低甚至枯槁无光泽，行动稍迟缓，对光声刺激反应更为迟钝，饮食量减少；光照7 d 及14 d 组体质量较正常对照组、光照1 d 及3 d 组减轻（P＜0.05），而光照1 d、3 d 组的体质量与正常对照组比较，在各时间点差异无统计学意义；各组大鼠在饲养3、7、14 d 体质量均较饲养0 d 增加（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of body mass of rats between different feeding times of each group表1 各组大鼠不同饲养时间的体质量比较（n=8，g，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F组间=4.840＊，F时间=2 294.410＊＊，F交互=102.980＊＊；a与正常对照组比较，b与光照1 d组比较，c与光照3 d组比较，d与光照7 d组比较，A与0 d比较，P＜0.05。

组别正常对照组光照1 d组光照3 d组光照7 d组光照14 d组F 0 d 186.88±6.42 186.63±5.66 187.50±3.78 186.13±3.94 187.38±6.23 0.089 1 d 190.25±6.30 190.13±5.96 190.75±4.03 189.13±3.94 190.38±6.23 0.101 3 d 196.63±6.17A 196.50±5.90A 193.13±4.85A 193.63±3.25A 195.50±6.12adA 0.734＊7 d 208.25±6.00A 208.50±5.10A 204.00±3.70A 198.25±4.50abcA 199.88±5.30abcdA 7.539＊＊14 d 230.50±6.12A 228.63±5.90A 223.13±3.44A 203.63±3.74abcA 202.25±5.18abcdA 34.697＊＊F 65.188＊＊45.107＊＊105.442＊＊25.906＊＊9.180＊＊

2.2 蓝光照射对ERG的影响与正常对照组比较，光照1 d 组ERG a 波、b 波潜伏期及振幅差异均无统计学意义；光照3、7 及14 d 组的ERG b 波潜伏期逐渐延长，a波、b波振幅逐渐降低（P＜0.05），见表2。

Tab.2 Comparison of latency and amplitude of ERG a wave and b wave between the five groups表2 各组ERG a波、b波潜伏期和振幅比较（n=8，）

＊P＜0.05；a与正常对照组比较，b与光照1 d组比较，c与光照3 d组比较，d与光照7 d组比较，P＜0.05。

a波b波组别正常对照组光照1 d组光照3 d组光照7 d组光照14 d组F潜伏期/ms 18.53±3.48 18.09±3.34 25.9±2.28ab 29.38±5.39ab 41.96±5.26abcd 44.786＊振幅/μV 46.81±5.32 46.95±5.14 34.35±3.78ab 26.99±5.34abc 10.68±1.20abcd 90.300＊潜伏期/ms 40.08±5.80 39.44±4.78 37.81±5.67ab 50.57±3.91abc 63.91±5.56abcd 36.687＊振幅/μV 96.48±7.16 96.11±6.73 81.03±5.22ab 73.51±8.00abc 38.02±5.38abcd 37.006＊

2.3 蓝光照射对视网膜的影响正常对照组和光照1 d 组大鼠的眼底未见明显异常，视网膜平伏，视网膜血管、视盘结构清晰可见，未见出血点及黄白色点状颗粒；光照3 d 组大鼠眼底视网膜平伏，偶见出血点和散在的视网膜脱色素改变；光照7 d组大鼠眼底见视盘色淡，视网膜上见散在点状出血点、黄白色点状颗粒物，视网膜静脉迂曲扩张，伴视网膜脱色素改变；光照14 d组眼底见视盘色淡，视网膜动脉呈铜丝样甚至银丝样外观，视网膜上见大量黄白色点状渗出，视网膜静脉迂曲扩张，伴大量视网膜脱色素改变，见图2。

Fig.2 Fundus color photos of BN rats of the five groups图2 各组BN大鼠眼底彩照

2.4 视网膜病理学观察 HE染色显示正常对照组视网膜形态正常，视网膜各层结构清楚，光感受器内、外节排列整齐规则，外核层排列整齐规则；光照1、3 d 组大鼠视网膜各层结构清晰，但在光照3 d 组见RPEc层基底部色素颗粒明显增多，外核层可见轻度细胞核固缩现象；光照7、14 d 组大鼠视网膜光感受器内节（IS）/外节（OS）空隙增大、结构排列紊乱，外核层细胞核固缩，RPEc层基底部色素颗粒沉积及RPEc下局灶性隆起，见图3。与正常对照组比较，光照3、7 及14 d 组视网膜变薄（P＜0.05），但光照3、7及14 d组视网膜厚度差异无统计学意义，见表3。

Tab.3 Comparison of retinal thickness and ROS content between five groups表3 各组大鼠视网膜厚度及视网膜ROS含量的比较（n=8，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，a与正常对照组比较，b与光照1 d组比较，c与光照3 d组比较，d与光照7 d组比较，P＜0.05。

组别正常对照组光照1 d组光照3 d组光照7 d组光照14 d组F视网膜厚度/μm 46.67±3.71 45.54±3.18 41.87±1.58a 40.89±1.32ab 39.87±1.85ab 11.740＊视网膜ROS含量/（U/mg）151.75±9.68 157.24±6.63 200.73±9.38ab 277.09±19.07abc 324.85±15.95abcd 257.39＊＊

Fig.3 Retinal HE staining of BN rats(×40)图3 BN大鼠视网膜HE染色（×40）

2.5 各组大鼠视网膜ROS 含量比较与正常对照组比较，光照3、7、14 d 组大鼠视网膜ROS 含量升高（P＜0.05），且光照1、3、7、14 d组视网膜ROS含量逐渐升高（P＜0.05），见表3。

3 讨论

视网膜是高耗氧量及高代谢组织，视网膜光感受器细胞IS含有大量的线粒体、核糖体等，视网膜光感受器OS 主要由膜盘构成，含有视色素，接受光线刺激后经一系列反应完成光传导［7］。RPEc 含有脂褐素、黑色素、丰富的线粒体、内质网等，具有储存转运视色素、吞噬感光细胞外节脱落的膜盘、清除氧自由基、分泌细胞因子等功能，在参与、维护视网膜功能及视觉形成中有重要作用［8］。黑色素具有很强的清除ROS、氧自由基及吸收高辐射射线能量的作用［9］。有色鼠眼部的黑色素主要分布在虹膜、RPEc及脉络膜中，当光线进入鼠眼后，首先由虹膜遮挡部分光线；RPEc及脉络膜无法像虹膜那样直接遮挡光线，而是RPEc及脉络膜中丰富的黑色素通过清除氧自由基发挥了视网膜光损伤的保护作用［2，6］。研究显示，蓝光可引起大鼠或小鼠视网膜结构和功能的损伤，其中视网膜光感受器细胞和RPEc凋亡损伤是导致视网膜光损伤的重要机制［4-5］。Li 等［10］发现SD大鼠连续8周暴露于5.03 Lux的蓝光3、6、12 h后，视网膜光感受器细胞和RPEc出现退行性改变，首先光感受器细胞OS 的膜盘肿胀、空泡样改变，光感受器细胞IS线粒体肿胀、减少，随后出现光感受器细胞核固缩，进而诱导光感受器细胞的凋亡；随着光感受器细胞的凋亡，RPEc 层变薄，数量减少、细胞破碎裂解。Lin 等［11］将BN 大鼠每日暴露于150 Lux 的蓝光中3 h并在大鼠暴露蓝光7、14 d后发现BN大鼠出现视网膜静脉迂曲扩张和白色点状渗出，视网膜变薄，视网膜IS/OS 层变薄。本研究利用（1 000±100）Lux蓝光照射BN 大鼠，发现大鼠在光照3 d 后对光声刺激的反应更迟钝，尤以在光照7、14 d后其精神状态、饮食、毛发光泽及对光声刺激明显减弱，体质量减轻；眼底可见较为明显的视网膜静脉迂曲扩张、视网膜点状出血及局灶性视网膜色素上皮脱失，视网膜变薄，IS/OS 层排列紊乱、萎缩，外核层核固缩，推测大鼠在光照7 d 时已出现光感受器细胞和RPEc 损伤，视觉受到影响，与Lin等［11］的研究结果相似。在本研究中BN大鼠在蓝光照射3 d后眼底已经出现了视网膜外核层的轻度核固缩、视网膜脱色素，并伴有RPEc层基底部色素颗粒增多；光照7 d后RPEc层基底部色素颗粒的沉积更为明显，考虑光照3 d时已出现光感受器细胞的轻度损伤。

ERG a波记录是光感受器细胞的功能，而b波主要记录双极细胞、Müller细胞的功能。研究显示，光损伤后大鼠光感受器细胞IS结构紊乱，双极细胞在光感受器细胞发生凋亡前已出现损伤，随后Müller细胞网络支架坍塌，形成类似于“星形细胞瘢痕”［12-13］。本研究中大鼠光照3 d 时，ERG a 波、b 波的振幅明显下降，潜伏期延长，推测在大鼠光照3 d后，视网膜光感受器细胞凋亡，视网膜外核层出现核固缩，导致视网膜光感受器细胞损伤；而双极细胞、Müller细胞的损伤则影响了光线在神经感觉层的传导，且随着蓝光光照的时间延长，视网膜光感受器的损伤更为明显，这与笔者观察到的大鼠视网膜的病理结构表现相符。

蓝光诱导的氧化应激反应在视网膜光感受器的细胞凋亡中具有重要作用［14-15］，黑色素可有效保护光照后的视网膜组织，减少氧化应激反应对视网膜的光损伤［2，4，16］。Marie 等［17］研究发现，蓝光照射后RPEc产生了大量ROS并发生氧化应激反应，导致视网膜线粒体功能障碍及细胞凋亡。Nakamura 等［18］采用1 100 Lux 的蓝光对C57BL/J 小鼠进行照射，发现小鼠在蓝光照射3 d后视网膜RPEc和光感受器细胞出现严重的凋亡，主要表现为光感受器细胞层和RPEc层变薄，结构紊乱。可见光照射有色鼠及白化鼠后，有色鼠的视网膜光损伤程度明显低于白化鼠，可能是有色鼠的RPEc 黑色素减少视网膜组织的氧化应激反应，快速有效的清除氧自由基，保护视网膜［2，19］。本研究中大鼠视网膜组织ROS 含量随着蓝光照射时间延长逐渐增加，考虑大鼠在连续蓝光照射后视网膜组织发生氧化应激反应，损伤大鼠视网膜光感受器细胞及RPEc。体内未及时清除的ROS在加重氧化应激反应的同时［20-21］，亦可抑制RPEc中溶酶体吞噬光感受器细胞OS，引起脂褐质的堆积［22］，脂褐质中含有N 视黄基视黄乙醇胺对蓝光特别敏感，可进一步引起RPEc凋亡、线粒体DNA功能障碍及氧化应激反应加重［2，17，22］，形成恶性循环。在氧化应激的环境下，视网膜光感受器细胞OS损伤导致大量膜盘脱落，RPEc 本身遭受氧化损伤，同时RPEc及其黑色素需要超负荷清除产生的ROS、吞噬脱落的光感受器细胞OS，最终RPEc功能失代偿，细胞凋亡甚至裂解，加重脂褐质的堆积，因此在RPEc基底部可见大量的脂褐质、色素颗粒沉积并引起炎性因子的积聚，破坏RPEc层及脉络膜毛细血管复合体的完整性，出现RPE基底部的局灶性隆起，甚至为新生血管的形成提供一个空间平台。本研究观察到光照3 d组大鼠RPE 层基底部色素颗粒增多、积聚，尤以光照7 d组大鼠及光照14 d组大鼠的更为明显，并伴眼底视网膜脱色素的表现，甚至在光照14 d 组大鼠中可见RPEc层局灶性隆起，加速了wAMD的发生发展。

综上，蓝光持续照射BN大鼠可产生氧化应激反应，导致慢性视网膜光损伤，且随着照射时间延长，视网膜光损伤程度愈重。这种蓝光导致的慢性视网膜光损伤值得引起研究者的重视，后期将继续深入研究其发病机制，为进一步研究视网膜光损伤的防治手段提供理论基础。