线粒体自噬-NLRP3炎症小体通路在新生大鼠缺血性脑损伤中的作用研究

林永文，陈巧媚，敖当，黄炳龙，骆成珠，李承燕

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是指缺氧或窒息导致的新生儿大脑缺氧缺血性损伤，发达国家的发病率为1‰～8‰，发展中国家则高达26‰，是足月新生儿致残的主要疾病［1］。脑缺血-再灌注损伤（CIRI）是新生儿HIE主要病理生理学改变，线粒体自噬-炎症小体在其中发挥重要作用［2-3］。研究发现，缺血可导致神经元中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体活化［4］，抑制NLRP3 炎症小体活化可减轻炎症反应和脑缺血-再灌注损伤［5］。NLRP3 炎症小体的活化常伴随线粒体自噬调控的紊乱，同时线粒体损伤是NLRP3 炎症小体过度激活的重要原因［6］。抑制线粒体复合物Ⅰ或复合物Ⅲ会增加线粒体内活性氧（ROS）生成，进而触发NLRP3炎症小体激活［7］。激活Parkin依赖的线粒体自噬可抑制NLRP3炎症小体的活化，减轻肾脏及肝脏的缺血-再灌注损伤［8-9］。目前鲜见有关新生大鼠CIRI 后线粒体自噬与NLRP3炎症小体相互作用的研究。本研究旨在探讨线粒体自噬与NLRP3 炎症小体途径在改善CIRI 中的作用过程和机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 1 周龄新生SD 大鼠42 只，体质量（15±3）g。由SPF级成年健康SD大鼠（雌鼠10只，雄鼠5只）配种所生，体质量（220±30）g，购自北京斯贝福生物技术有限公司［动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010］。本实验通过广东医科大学实验动物福利伦理委员会批准（审批号：GDY2102087）。 BCA 蛋白浓度测定试剂盒、Mdivi-1（Dynamin 抑制剂）、Western 一抗稀释液（中国碧云天公司），MCC950（选择性的NLRP3 抑制剂）和Ac-YVAD-cmk（选择性caspase-1 抑制剂，美国MedChemExpress 公司），胱天蛋白酶（caspase）-1 兔单克隆抗体、caspase-8 兔单克隆抗体、LC3Ⅱ/Ⅰ兔单克隆抗体、二甲亚砜（DMSO，美国CST公司），凋亡相关微粒蛋白（ASC）、NLRP3、anti-SQSTM1/P62、PTEN 诱导激酶1（PINK1）、Parkin、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、线粒体外膜转位酶20（TOMM20）兔单克隆抗体（英国Abcam公司），β-actin抗体（中国弗德生物公司），过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L，中国oster 公司）。化学发光凝胶成像系统（上海天能公司），OLYMPUS显微照相系统、普通光学显微镜（日本Olympus 公司），JEM-1400120V型透射电子显微镜（日本电子株式会社）。

1.2 动物模型构建及分组 42 只新生SD 大鼠按照随机数字表法分为Sham 组、CIRI 组、CIRI+DMSO 组、CIRI+Mdivi-1组、CIRI+MCC950 组及CIRI+Ac-YVAD-cmk 组，每组7 只。除Sham 组外，其他各组采用单侧颈总动脉阻断法建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）模型［10］。Sham 组：仅暴露左颈总动脉，不予夹闭。CIRI 组：暴露左颈总动脉，用血管夹夹闭左侧颈总动脉60 min 后恢复血流。CIRI+DMSO 组：造模后立即腹腔注射10%DMSO溶液（0.2 mL）。CIRI+Mdivi-1组：术前30 min 给予Mdivi-1 25 mg/kg 腹腔注射（0.2 mL）。CIRI+MCC950 组：术前30 min 给予MCC950 10 mg/kg 腹腔注射（0.2 mL）。CIRI+Ac-YVAD-cmk 组：术前30 min 给予Ac-YVAD-cmk 2 mg/kg腹腔注射（0.2 mL）。

1.3 主要观察指标 （1）神经行为障碍评分：HIBD模型制备后24 h，Londa法进行神经行为障碍评分［10］。（2）苏木精-伊红染色法（HE）检测海马CA1区细胞形态：组织置于4%多聚甲醛中固定24 h，梯度乙醇脱水。将乙醇置换为二甲苯进行标本透明、浸蜡及石蜡包埋。选取海马体最大切面，3 μm连续切片。用二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水后，将切片置于中性树胶封片。使用普通光学显微镜观察各组海马CA1 区细胞形态。（3）透射电子显微镜观察神经元超微结构：完整剥离海马体，取约1 mm3海马CA1区组织，用3%戊二醛固定（4 ℃，24 h），继续予后固定、脱水、包埋等处理，透射电子显微镜观察海马神经元细胞形态、肿胀线粒体数及突触数。（4）Western blot检测线粒体自噬和NLRP3炎症小体通路相关蛋白表达：将新鲜组织放入RIPA 裂解液中研磨后于4 ℃12 000 r/min 离心10 min。SDS-PAGE电泳（恒压60 V 30 min后120 V 60 min），使用0.22 μm PDVF 膜在转膜液中进行转膜（300 mA 60 min及250 mA 60 min）。用TBST洗膜后分别加入一抗稀释液（均1∶1 000）4 ℃孵育过夜；TBST 漂洗后加用相应种属稀释二抗（1∶5 000）孵育2 h，洗涤后ECL显影及曝光，使用化学发光凝胶成像系统Tanon-5200检测，采用Image J软件分析灰度值。以β-actin 或GAPDH 作为内参照，检测PINK1、Parkin、TOMM20、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62 及NLRP3、ASC、caspase-1、caspase-8蛋白表达情况，每组取1只，重复3次。

1.4 统计学方法 采用Graph Prism 8.0.2 统计软件分析数据。符合正态分布的计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经行为障碍评分 与Sham 组比较，CIRI 组神经行为障碍评分均增加（P＜0.05）；与CIRI+DMSO 组比较，CIRI+Mdivi-1 组神经行为障碍评分增加（P＜0.05）；与CIRI+Mdivi-1 组比较，CIRI+MCC950组及CIRI+Ac-YVAD-cmk 组神经行为障碍评分降低（P＜0.05），见图1。

2.2 海马CA1 区细胞形态 在新生大鼠海马CA1区，Sham 组神经元排列整齐紧密，无细胞核固缩及核碎裂；CIRI 组及CIRI+DMSO 组神经元均排列疏松、紊乱，出现空泡化及水肿，可见较多核固缩及核碎裂；CIRI+Mdivi-1 组可见明显神经元空泡化及水肿，细胞排列杂乱、疏松，可见较多核固缩；CIRI+MCC950组细胞排列整齐，无空泡化，有少量核固缩及核碎裂；CIRI+Ac-YVAD-cmk 组细胞分布疏松、排列紊乱，核固缩及核碎裂多见，见图2。

2.3 神经元细胞超微结构 在新生大鼠海马CA1区，Sham 组神经元核膜完整，线粒体及突触结构清晰，突触小泡数量较多、排列紧密；与Sham 组比较，CIRI组与CIRI+DMSO组部分神经元核膜断裂，线粒体嵴断裂，肿胀线粒体数增多，突触小泡稀疏且数量减少，突触前膜结构模糊，后膜肿胀；与CIRI+DMSO组比较，CIRI+Mdivi-1 组神经元核膜断裂，胞核碎裂，线粒体嵴中断或消失，肿胀线粒体数增多，突触小泡数量明显减少，突触后膜水肿，可见凋亡神经元；CIRI+MCC950 组神经元核膜清晰，部分线粒体呈空泡样改变，可见线粒体自噬体及突触小泡，突触结构完整，与CIRI+DMSO 组和CIRI+Mdivi-1 组比较，突触数增多，肿胀线粒体数减少；CIRI+Ac-YVAD-cmk组神经元核膜模糊，部分线粒体嵴中断，线粒体及突触小泡数量减少，突触后膜肿胀，线粒体自噬体少见，与CIRI+DMSO组和CIRI+Mdivi-1组比较，突触数增多，肿胀线粒体数减少，见表1、图3。

Tab.1 Comparison of synapses and swelling mitochondrias observed by transmission electron microscopy in the hippocampus CA1 tissue between six groups of neonatal rats表1 各组新生大鼠海马CA1区透射电镜观察结果比较（n=7，个/视野，）

Tab.1 Comparison of synapses and swelling mitochondrias observed by transmission electron microscopy in the hippocampus CA1 tissue between six groups of neonatal rats表1 各组新生大鼠海马CA1区透射电镜观察结果比较（n=7，个/视野，）

＊＊P＜0.01，＊P＜0.05；a与Sham组比较，b与CIRI+DMSO组比较，c与CIRI+Mdivi-1组比较，P＜0.05；表2—3同。

组别Sham组CIRI组CIRI+DMSO组CIRI+Mdivi-1组CIRI+MCC950组CIRI+Ac-YVAD-cmk组F突触数4.143±0.690 2.286±0.756a 2.286±0.951a 0.857±0.378b 5.286±0.756bc 4.429±0.535bc 39.570＊＊肿胀线粒体数0.857±0.378 3.714±0.488a 4.000±0.817a 6.143±0.900b 1.714±0.756bc 2.857±0.690bc 50.250＊＊

Fig.3 Ultrastructure of hippocampal CA1 tissue in each group of newborn rats(A1—F1，×8 000；A2—F2，×30 000；A3—F3，×60 000)图3 各组新生大鼠海马CA1区超微结构表现（A1—F1，×8 000；A2—F2，×30 000；A3—F3，×60 000）

2.4 各组新生大鼠海马组织中线粒体自噬-NLRP3炎症小体相关蛋白表达情况 与Sham组比较，CIRI组PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ及NLRP3、ASC、caspase-1、caspase-8 蛋白表达增加，TOMM20、P62 蛋白表达降低（P＜0.05）；与CIRI+DMSO组比较，CIRI+Mdivi-1 组PINK1、Parkin、LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表达下调，TOMM20、P62、NLRP3、caspase-8、caspase-1 蛋白表达增加（P＜0.05）。与CIRI+Mdivi-1 组比较，CIRI+MCC950 组及 CIRI+Ac-YVAD-cmk 组 PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达增加，CIRI+MCC950 组NLRP3、caspase-1、caspase-8 蛋白及CIRI+Ac-YVAD-cmk 组caspase-1、caspase-8 蛋白表达下调（P＜0.05），见图4，表2、3。

Tab.2 Comparison of mitophagy protein relative expression levels in hippocampal CA1 tissue of newborn rats between the groups表2 各组大鼠新生大鼠海马CA1区线粒体自噬相关蛋白相对表达水平比较（n=3，）

Tab.2 Comparison of mitophagy protein relative expression levels in hippocampal CA1 tissue of newborn rats between the groups表2 各组大鼠新生大鼠海马CA1区线粒体自噬相关蛋白相对表达水平比较（n=3，）

组别PINK1ParkinTOMM20LC3Ⅱ/ⅠP62 Sham组CIRI组CIRI+DMSO组CIRI+Mdivi-1组CIRI+MCC950组CIRI+Ac-YVAD-cmk组F 0.583±0.149 1.114±0.293a 1.096±0.283a 0.581±0.073b 1.628±0.395c 1.388±0.341ac 6.860＊＊0.373±0.056 0.867±0.125a 0.864±0.126a 0.413±0.027b 1.263±0.256c 0.903±0.168c 15.740＊＊1.508±0.325 0.861±0.195a 0.895±0.143a 1.874±0.275b 0.746±0.092c 0.854±0.166c 13.670＊＊0.177±0.062 0.345±0.103a 0.365±0.128a 0.183±0.047b 0.530±0.163c 0.377±0.081c 4.830＊1.284±0.238 0.719±0.037a 0.723±0.032a 1.425±0.099b 0.623±0.067c 0.685±0.079c 27.510＊＊

Tab.3 Comparison of NLRP3 inflammasome protein relative expression levels in hippocampal CA1 tissue of newborn rats between the groups表3 各组大鼠新生大鼠海马CA1区NLRP3炎症小体蛋白相对表达水平比较（n=3，）

Tab.3 Comparison of NLRP3 inflammasome protein relative expression levels in hippocampal CA1 tissue of newborn rats between the groups表3 各组大鼠新生大鼠海马CA1区NLRP3炎症小体蛋白相对表达水平比较（n=3，）

组别Sham组CIRI组CIRI+DMSO组CIRI+Mdivi-1组CIRI+MCC950组CIRI+Ac-YVAD-cmk组F 0.326±0.079 0.869±0.253a 0.826±0.278a 1.117±0.302 0.511±0.097c 0.673±0.090 5.510＊0.233±0.044 0.482±0.088a 0.482±0.072a 0.825±0.189b 0.366±0.087c 0.488±0.119 9.630＊＊0.478±0.067 1.039±0.081a 1.027±0.137a 1.443±0.086b 0.516±0.050bc 0.648±0.051bc 60.340＊＊0.430±0.100 0.835±0.142a 0.794±0.172a 1.193±0.109b 0.647±0.148c 0.758±0.055c 11.690＊＊ASCNLRP3caspase-8caspase-1

Fig.4 Western blot bands of mitophagy-NLRP3 inflammasome protein in hippocampal CA1 tissue in each group of newborn rats图4 各组新生大鼠海马CA1区线粒体自噬-NLRP3炎症小体蛋白Western blot条带

3 讨论

目前，有关NLRP3炎症小体激活与线粒体自噬在新生大鼠CIRI 中的相互作用和调控机制尚未完全阐明［11］。NLRP3 炎症小体是在脑缺血中研究较多的炎症小体，其介导的脑缺血损伤与炎症反应密切相关［4］。Gong 等［12-13］发现，NLRP3 炎症小体在CIRI后主要在神经元中表达。在脑缺血体外神经元模型中，缺血导致神经元中NLRP3炎症小体各组成蛋白表达增加及活化后产物增多，提示脑缺血导致神经元NLRP3 炎症小体的活化。而抑制NLRP3 炎症小体可抑制星形胶质细胞和小胶质细胞激活，降低炎症因子的水平，从而减轻脑缺血后的炎症反应［14-15］。线粒体保护剂可抑制脑缺血-再灌注后NLRP3 炎症小体的活化［12］。本研究结果显示，在CIRI 组NLRP3 炎症小体各组成蛋白（NLRP3、ASC）表达增加，活化后产物（caspase-1、caspase-8）增多，表明新生大鼠CIRI 可导致NLRP3 炎症小体活化。使用NLRP3 炎症小体抑制剂MCC950 后，新生乳鼠的神经行为障碍评分、海马CA1 区神经元形态学表现及超微结构均较CIRI+DMSO 组改善，提示抑制NLRP3 炎症小体的活化可改善新生乳鼠的CIRI。同时，透射电镜发现，加入MCC950后线粒体自噬体增多，线粒体自噬相关蛋白表达水平增加，提示抑制NLRP3 炎症小体活化可以激活线粒体自噬，改善神经元突触结构改变，改善新生大鼠CIRI 的神经损伤。

线粒体自噬作为一种选择性自噬，可消除功能失调或多余的线粒体，从而微调线粒体的数量，维持能量代谢［16］。激活线粒体自噬可清除过度聚集和受损的线粒体，从而减少CIRI 引起的神经元损伤［17］。受损线粒体及其释放的线粒体信号在调节NLRP3炎症小体活化中起关键作用［9］。He等［18］发现，激活Parkin途径依赖的线粒体自噬可抑制NLRP3炎症小体激活，减少CIRI。本研究结果显示，加入Mdivi-1后NLRP3 炎症小体相关蛋白表达水平较CIRI+DMSO组明显增加。同时CIRI+Mdivi-1组新生乳鼠的神经行为障碍评分较CIRI+DMSO 组增加，海马CA1 区神经元形态学表现及超微结构明显损伤，提示抑制线粒体自噬可激活NLRP3炎症小体，加重新生乳鼠的CIRI。

NLRP3 炎症小体和caspase-1 介导细胞焦亡通路的激活是脑出血后神经功能缺损的最常见原因［19］。活化的caspase-1引起细胞膜穿孔，从而诱导细胞凋亡并诱发强烈的炎症反应［20］。Ac-YVAD-cmk 是caspase-1 选择性抑制剂，已被证明对缺血性脑损伤及脑出血有神经保护作用［21-22］。本研究结果显示，CIRI+Ac-YVAD-cmk 组的海马CA1 区神经元形态学表现及超微结构较CIRI+DMSO组改善，提示抑制caspase-1活化有神经保护作用。

综上所述，抑制线粒体自噬可引起NLRP3 活化，加重新生大鼠缺血性脑损伤；而抑制NLRP3 活化可激活线粒体自噬，神经损伤减轻。增强线粒体自噬或抑制NLRP3 炎症小体活化可能是治疗HIE的药物研究方向。