西瓜花叶病毒西葫芦分离物的基因组及其侵染性克隆

刘莉铭，彭 斌，康保珊，吴会杰，刘 茜，古勤生

（1.河南省果树瓜类生物学重点实验室·中国农业科学院郑州果树研究所 郑州 450009；2.中国农业科学院中原研究中心 郑州 450009）

西 瓜 花 叶 病 毒（watermelon mosaic virus，WMV）属于马铃薯Y 病毒属（Potyvirus），主要分布在温带和地中海地区，自然条件下通过蚜虫以非持久性方式进行传播，也可通过机械方式进行传播。该病毒寄主范围广泛，可侵染西瓜、甜瓜等多种葫芦科作物，也可侵染胡萝卜[1]、刺槐[2]、芝麻[3]、甜椒[4]、兰花[5]、百香果[5]、人参[6]、臭椿[7]、紫薇[8]、蜀葵[9]等作物，主要引起植株矮化、叶片花叶和畸形，影响作物的商品性。

WMV 是一种单链正义RNA 病毒，基因组全长约为10 kb，编码一个多聚蛋白，该蛋白可被自身编码的蛋白酶识别，切割成10 个成熟蛋白P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb 和CP，在P3 编码区由转录滑动机制产生第11 个蛋白P3N-PIPO[10]。基于P1、NIb-CP 和CP 的N 端核苷酸序列，WMV 分成经典组（CL）、组2（G2）和新兴组（EM）。CL 组包含法国流行的经典分离物，EM组包含法国东南部新发生的在西葫芦上引起严重症状的分离物，G2 组分离物无特殊生物学性状，来自世界不同地区[11-12]。研究显示，该病毒基因组不同区域的分子变异性有所差异，且基因组内存在大量的重组断裂点[4，13-17]，进行系统进化分析时有必要获得病毒的全基因组序列。

病毒侵染性克隆的获得使得研究RNA 病毒实现了在DNA 水平上进行各种分子操作，近年来，病毒侵染性克隆应用越来越广泛[18-21]。前期中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组（本团队）从西葫芦发病植株上分离得到WMV分离物CH99/69[22]，在此基础上，笔者拟通过扩增获得该分离物的全基因组序列，并进行全基因组序列分析，同时通过构建它的全长cDNA 克隆，分析其在不同瓜类作物上的侵染性，为在瓜类作物上开展该病毒的致病和抗病相关的工作奠定基础。考虑到目前已有WMV 其他分离物侵染性克隆成功构建的报道[23-25]，该克隆的获得也将有助于开展不同分离物之间分子变异性、致病性和适应性的联合分析，以更好地揭示WMV 分子进化机制，为控制该病毒导致的病害探索新的策略。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2021 年4—9 月在中国农业科学院郑州果树研究所进行。供试WMV 分离物CH99/69来源于西葫芦发病植株，由中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组鉴定和保存。植物表达载体pXT1 由南京农业大学陶小荣教授馈赠。

1.2 方法

1.2.1 载体构建 取约0.1 g 西葫芦发病叶片，利用RNAsimple 总RNA 提取试剂盒和PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser 提取叶片总RNA和合成cDNA，具体操作参照试剂盒说明书。从GenBank 数据库中下载并比对分析WMV 的全基因组序列，根据序列的保守性，设计5 对引物HF-W-1F/W-1R、W-2F/W-2R、W-3F/W-3R、W-4F/W-4R、W-5F/HF-W-5R（表1），以合成的cDNA 为模板，将分离物CH99/69 的全基因组分成5 段进行扩增，随后利用NEBuilder 高保真DNA 组装预混液将扩增获得的5 个PCR 产物与经StuI 和SmaI 双酶切处理的植物表达载体pXT1 进行同源重组、转化、菌液PCR 筛选、测序验证，最终获得含有CH99/69全基因组的cDNA 克隆pWMV-CH99。1.2.2 序列分析 对pWMV-CH99 进行测序、拼接，获得CH99/69 分离物的全基因组序列。从Gen‐Bank 数据库中下载38 条来自不同国家的WMV 分离物全基因组序列，利用ClustalW 软件将它们与CH99/69 分离物进行序列比对，再用BioEdit 软件对它们进行全基因组核苷酸和氨基酸序列一致性分析[26]。以大豆花叶病毒（soybean mosaic virus，SMV，NC_002634）为外组，基于以上WMV 分离物的全基因组核苷酸序列，利用Mega X 软件中的邻接法（neighbor-joining，NJ）进行系统进化分析[27]，1000 次重复。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.2.3 接种试验 试验于2021 年6—8 月在中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组温室进行。其中，甜瓜品种为白玫，由新疆农业科学院哈密瓜研究中心提供；西瓜品种为红和平，种子购自浙江浙农种业有限公司；西葫芦品种为珍玉358，种子购自河南豫艺种业科技发展有限公司；瓠瓜品种为亲抗水瓜，种子购自湖南雪峰种业有限公司。将pWMV-CH99 转入农杆菌菌株GV3101 中，随后进行培养、接种，将pWMV-CH99转入农杆菌菌株GV3101 中，随后进行培养、接种，将pWMV-CH99 利用农杆菌介导的方法接种甜瓜、西瓜、西葫芦和瓠瓜植株，并将发病叶片进行摩擦接种分析，具体方法参照刘莉铭等[28]的报道。采集系统发病叶片，以W-8674F/W-10047R 为引物（扩增的目的片段为1374 bp），利用HiScript® II One Step RT-PCR Kit（Dye Plus）对病毒的侵染情况进行检测分析。另外，以W-9399F/W-T7-9782R 为引物，对CH99/69 基因组9399～9782 nt 区域进行扩增，经体外转录合成地高辛标记的RNA 探针，利用dot blot 方法检测植株叶片中WMV 的侵染情况。

2 结果与分析

2.1 WMV分离物CH99/69基因组结构分析

CH99/69 分离物基因组全长为10 047 nt，它的5′UTR 和3′UTR 分别对应基因组的1～132 nt 和9796～10 047 nt，全基因组编码1 个由3220 个氨基酸组成的多聚蛋白（133～9795 nt），经蛋白酶切割，形成10 个成熟的蛋白质，同时P3 编码区内部通过+2 移码产生PIPO，它可与P3 的N 端融合表达形成P3N-PIPO 蛋白，其基因组结构如图1 所示，GenBank 登录号为MN296125。

图1 WMV 分离物CH99/69 的基因组结构示意图Fig.1 Schematic representation of WMV isolate CH99/69 genome organization

2.2 分离物CH99/69序列分析

序列一致性分析结果（表2）显示，不同WMV分离物之间的全基因组核苷酸、多聚蛋白核苷酸和多聚蛋白氨基酸序列一致性分别为81.10%～99.70%、81.10%～99.80%、87.20%～99.80%，分离物CH99/69 与这些分离物的序列一致性分别为81.40% ～94.80% 、81.40% ～94.70% 、88.40% ～97.20%。其中，CH99/69 与中国乌鲁木齐的火参果分离物Urumqi（MW345911）的序列一致性最高，分别为94.80%、94.70%、97.20%，与中国陕西的西葫芦分离物WMV-WS（KX664483）一致性次之，与中国辽宁的臭椿分离物WMV-GZca（MF418043）一致性最低。

表2 WMV 分离物CH99/69 与其他分离物全基因组核苷酸和氨基酸的序列一致性Table 2 The identity of nucleotide sequences and amino acid sequences of complete genome between WMV isolate CH99/69 and other isolates %

基于WMV 全基因组序列的系统进化分析结果显示，供试39 个WMV 分离物可以分为4 组，本研究获得的CH99/69 分离物与来自中国乌鲁木齐的火参果分离物Urumqi（MW345911）、中国陕西的西葫芦分离物WMV-WS（KX664483）和法国的西葫芦分离物WMV-Fr（AY437609）亲缘关系较近，它们均聚于Ⅰ组中，而与中国的人参分离物WMV-Pg（KX926428） 、臭 椿 分 离 物 WMV- GZca（MF418043）、蜀葵分离物hollyhock（MK217416）亲缘关系最远（图2）。

图2 基于全基因组序列的WMV 分离物系统发育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of WMV isolates based on complete genome sequence

2.3 分离物CH99/69全长cDNA克隆的侵染性

将CH99/69 的cDNA 克隆pWMV-CH99 利用农杆菌介导的方法接种甜瓜、西瓜、西葫芦和瓠瓜植株。接种后1 周左右，甜瓜、西葫芦和瓠瓜接种植株开始产生脉带、花叶或褪绿斑点，接种后2 周左右，西瓜接种植株开始产生花叶、卷叶症状（图3-A）。随着接种时间的延长，甜瓜和西瓜发病植株症状逐渐加重，叶片严重花叶、卷叶或畸形，植株矮化。PCR 检测和dot blot 检测证实发病植株确实被WMV 所侵染（图3-B～C）。将甜瓜发病叶片通过摩擦方式接种以上4 种瓜类作物，发现在接种1～2 周内所有接种植株也均可发病。以上研究说明分离物CH99/69 的侵染性克隆构建成功，该克隆在4 种供试瓜类作物上均可系统侵染并引起典型的花叶症状。

图3 WMV 分离物CH99/69 cDNA 克隆的侵染性Fig.3 Infectivity of WMV isolate CH99/69 cDNA clone

3 讨论与结论

本团队前期基于WMV CP 基因的序列对分离物CH99/69 进行了初步的系统进化分析，发现该病毒不同分离物之间具有一定的地理特异性，且CH99/69 与中国分离物WMV-CHN 亲缘关系较近[22]。笔者的研究基于WMV 的全基因组序列对其进一步进行了进化分析，发现在中国分离物中，CH99/69 与Urumqi 和WMV-WS 亲缘关系较近，与WMV-CHN 亲缘关系稍远，与WMV-Pg、hollyhock和WMV-GZca 亲缘关系更远，且来自其他国家（如法国、意大利、韩国和美国）的不同分离物在进化上也有一定的分化，说明WMV 分离物与地域差异不完全相关，该结果与前期结果[22]有所不同，而与Pozzi等、韩 盛 等[15，29]的 报 道 一 致。分 离 物CH99/69 与WMV-CHN、Urumqi 和WMV-WS 之间的序列比对结果显示，CH99/69 与WMV-CHN 的CP 蛋白氨基酸序列一致性（98.90%）介于CH99/69 与WMV-WS 和Urumqi 的一致性（96.80%、99.20%）之间，而CH99/69和WMV-CHN 的全基因组核苷酸、多聚蛋白核苷酸和多聚蛋白氨基酸的序列一致性均低于与WMV-WS 和Urumqi CH99/69 的一致性，而这与CH99/69 和WMV-CHN 之 间 其 他 区 域 如P3、CI、NIa-VPg、NIa-Pro 和NIb 的差异有关，该差异将导致基于CP部分序列和全基因组序列进行的系统进化分析结果会有所不同。因此，为了弥补基于病毒部分序列进行分析的局限性，有必要获得WMV 不同分离物的全基因组序列，并基于全基因组序列进行系统序列分析。

WMV 寄主范围较为广泛，既可侵染葫芦科作物，也可侵染多种非葫芦科作物[1-9]。任春梅等[30]分析了江苏省葫芦科作物WMV 的分子变异特征，发现各分离物与寄主之间的相关性不明显，而Niu等[31]对来自世界各地的WMV 分离物进行了分析，发现不同分离物与其寄主有一定的相关性。笔者的研究对来自6 种葫芦科作物（西葫芦、甜瓜、西瓜、黄瓜、火参果、刺果瓜）、5 种非葫芦科作物（紫薇、百香果、人参、臭椿、蜀葵）的39 个WMV 分离物进行了分析，发现来自同一寄主的不同分离物虽然可能分布在不同分支上，但来自葫芦科作物的所有分离物均聚集于Ⅰ～Ⅲ组中，来自非葫芦科作物的分离物均聚集于Ⅱ组和Ⅳ组中，且西葫芦分离物主要分布在Ⅰ组中，西瓜分离物仅分布在Ⅱ、Ⅲ组中，说明WMV 分离物与寄主之间具有一定的相关性，与Niu 等[31]的结果一致。

在WMV 侵染性克隆构建方面，目前已有较多报道，Desbiez 等[23]通过酵母重组、添加内含子的方法获得了WMV-FMF00-LL1 和WMV-FMF00-LL2两个分离物的侵染性克隆，该克隆经基因枪接种，成功侵染西葫芦。Aragonés 等[24]构建了弱毒株分离物Vera 的侵染性克隆，并通过农杆菌接种使其成功侵染甜瓜，引起较弱的症状。Moya-Ruiz 等[25]利用同源重组方法构建了MeWM7 分离物的侵染性克隆，经农杆菌接种，成功侵染甜瓜、西瓜、黄瓜、南瓜和西葫芦。笔者则利用同源重组方法构建了CH99/69 分离物的侵染性克隆，经农杆菌接种，成功侵染甜瓜、西瓜、西葫芦和瓠瓜。从系统进化分析结果来看，WMV-FMF00-LL1、Vera 和MeWM7 亲缘关系较近，均属于Ⅱ组成员，CH99/69 属于Ⅰ组成员，与它们亲缘关系较远。已知Vera 为弱毒株，在甜瓜上致病性较弱，通过序列分析发现，与其他分离物相比，该分离物存在3 个氨基酸差异位点（aa173、aa1231 和aa2226），分别位于P1、P3 和NIa-Pro 区域，推测这3 个位点与该分离物的弱致病性有关。在此基础上，可以进一步开展分子变异性、致病性和适应性的联合分析，以揭示WMV 分子致病机制和进化机制，为该病毒病的防控提供指导。