嵌合抗原受体T细胞治疗女性高发恶性肿瘤的研究进展和挑战

张 露 赵乐乐 解思凯 李海鹏 王俊杰 李正红

蚌埠医学院1. 生命科学院；2.公共卫生学院；3.精神卫生学院，安徽 蚌埠 233030

宫颈癌的相关病因是人乳头瘤病毒（human papilloma virus， HPV）感染，随着HPV 疫苗的面世及推广应用，宫颈癌可以从病因学的角度加以预防和控制。卵巢癌和子宫内膜癌的病因尚不明确，可能涉及个体、环境、遗传等多方面的因素。由于生理结构的差异性，乳腺癌在女性群体中的发病率远远高于男性。从现状来看，传统手段对于医治中晚期肿瘤患者收效甚微，生存率方面没有明显改善，肿瘤复发率高。通过基因工程改造患者的T细胞获得嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor T，CART）细胞，再回输患者体内，既可以获得更强的杀伤效应，又可以避免免疫排斥。该疗法在血液系统恶性肿瘤方向取得的巨大成功促使研究者将目光转向实体瘤方向，进行了关于CAR-T疗法针对女性高发恶性肿瘤治疗的一系列探索。

1 CAR-T的结构

嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）是一种可移植到免疫效应细胞（如T细胞、NK细胞）上的蛋白分子。CAR由胞外抗原结合结构域、跨膜区和胞内信号传导结构域3部分组成。CAR分子发展至今已有4代。纵观其发展史，可以发现第1代、第2代、第3代的区别是在前一代的基础上增加与T细胞激活信号区CD3ζ 链融合的共刺激因子，常见的主要有CD28、CD134、CD137和0X40等［1-2］，激活T细胞内JNK、ERK 等信号通路；最新诞生的第4 代CAR-T细胞，更多的是针对CAR-T在实际应用中面临的问题来设计，如在CAR-T构建时添加不同类型的细胞因子分泌型基因序列，改变CAR-T细胞易耗竭、浸润肿瘤组织困难等问题；设计双抗体靶点的CAR-T细胞是为了避免CAR-T疗法的脱靶效应，解决了肿瘤相关抗原特异性不足的问题。

2 关于女性高发恶性肿瘤的CAR-T疗法研究

2.1 宫颈癌

有学者研究靶向E7 蛋白的CAR-T 细胞［3］。统计显示约90%的宫颈癌与HPV持续感染相关［4］，相关性最大的为HPV16［5-6］。HPV16 E7： HLA CAR-T对宫颈癌细胞Ca Ski有显著杀伤效应；但是对HeLa杀伤效果不明显。检测CAR-T细胞与2种宫颈癌细胞共培养时上清液中γ-干扰素（interferon-γ， IFN-γ）和白介素-2（interleukin， IL-2）等细胞因子的变化，结果同样说明，CAR-T 对HeLa 细胞的杀伤效果更小。这提示我们，CAR-T疗法应用应视患者自身情况而定，不能一概而论。

另一款针对宫颈癌细胞上的细胞程序性死亡-配体1（programmed cell death 1 ligand 1， PD-L1）的PD1 CAR-T 在设计上较普通三代CAR-T 更为复杂［7］。根据法国居里研究所的科学家们发表的研究结果，敲除细胞因子信号传导抑制蛋白1（suppressor of cytokine signaling-1， SOCS1）基因可显著改善CD4+T细胞的持久性和CD8+T细胞的作用功效［8］。为了增强抗原性和降低转化活性，采用修饰的HPV16 E7 加载沉默SOCS1 的树突状细胞（dendritic cells，DCs），将DCs与PD1 CAR-T共培养。与对照组相比，由DCs 激活的PD1 CAR-T显著增加了IL-2、IFN-γ 和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的分泌，同时提高了抗肿瘤活性。这对改善宫颈癌免疫治疗方向有很重要的启发作用。

间皮素（mesothelin， MESO）和NK 细胞活化型受体（natural killer group 2D protein， NKG2D）的配体是过继细胞免疫疗法应用较多的靶点。针对宫颈鳞状细胞癌的MESO CAR-T 和NKG2D CAR-T 也被开发出来［9-10］，它们对MESO 和NKG2D 配体阳性宫颈癌细胞系展现高效抑制能力；选择免疫缺陷小鼠进行动物实验，记录小鼠肿瘤的生长速度和大小，MESO CAR-T和NKG2D CAR-T对不同类型宫颈癌治疗效果符合预期。

2.2 子宫内膜癌

Alba Rodriguez-Garcia 团队成员通过建立高表达苗勒管抑制物质Ⅱ型受体（Müllerian inhibiting substance type 2 receptor，MISIIR）的子宫内膜癌细胞AN3CA 的肿瘤模型评估靶向MISIIR 的GM7 CAR-T细胞的功能［11］。研究发现，与空载组和对照组相比，GM7 CAR-T治疗组小鼠的肿瘤体积分别减少1.8 倍和2.2 倍，体现了GM7 CAR-T 细胞对内源性MISIIR的抗原特异性反应。

关于子宫内膜癌的CAR-T 治疗相关基础研究报道很少。2020 年11 月13 日，重庆新桥医院和TCRCure 生物制药有限公司合作启动了一项I/II 期临床试验（NCTO4627740）［12］，目的是评估抗胎盘碱性磷酸酶（alkaline phosphatase placental，ALPP）嵌合抗原受体修饰的T 细胞治疗ALPP 阳性转移性卵巢癌和子宫内膜癌的安全性和有效性。主要通过出现不良反应的人数，抗ALPP CAR-T细胞在ALPP阳性患者中的无进展生存率以及输注6 个月后ALPP 阳性患者外周血中ALPP CAR-T 细胞的数量和百分比等作为评估指标。

2.3 卵巢癌

在卵巢癌靶向PD-L1 和粘蛋白16（mucoprotein 16， MUC16）抗原的CAR-T细胞研究中，Li等［13］构建了PD1-anti-MUC16 dual-CAR，PD1 single-CAR，和anti-MUC16 single-CAR 的串联片段，获得了单、双CAR-T细胞。实验证明，同时靶向两种抗原的CART细胞较靶向1种抗原的CAR-T细胞针对性更强。

异常血管使肿瘤生长，为免疫浸润提供屏障，并作为促肿瘤信号的来源。Santoro 等［14］的团队研究靶向肿瘤血管破环或肿瘤血管破裂来提高治疗效益。使用抗前列腺特异性膜抗原（anti-prostate specific membrane antigen，Anti-PSMA）的单链抗体J591和细胞内信号域：CD3ζ，CD28和CD137来生成P28BBζ CAR-T 细胞。该细胞的效应功能和持续性依赖于其设计中包含的信号域，CD28 和CD137 的共刺激增强了CAR-T细胞在体内的功能，产生更强的抗肿瘤反应［15］。这种同时携带2种共刺激因子的三代CAR-T 细胞能够识别并杀死从妇科肿瘤中分离出的原始人类内皮细胞。此外，它介导小鼠中表达hPSMA的血管肿瘤的消退。最后，在小鼠卵巢癌模型中，P28BBζ CAR-T细胞能够消融PSMA+血管，引起肿瘤细胞二次衰竭。

5T4 滋养层糖蛋白（trophoblast glycoprotein，TPBG）是一种肿瘤相关抗原，在包括卵巢癌在内的大多数实体瘤的细胞表面表达。Owens等［16］评估了5T4在卵巢癌的CAR-T细胞治疗中的作用。他们合成了2 种第2 代CAR 结构体：H8-CAR 和2E4-CAR（H8 单抗对5T4 的亲和力比2E4 单抗更高），发现H8 CAR-T或2E4 CAR-T在与卵巢癌细胞系SKOV-3或OVCAR-3共培养时均可产生较高水平的 IFN-γ，并且，亲和性较高的H8 CAR-T 比2E4 CAR-T 产生更多的IFN-γ。在动物实验中，与2E4 CAR-T 相比，H8 CAR-T处理的荷瘤小鼠的生存期显著增加。

尽管CAR-T细胞有定位于肿瘤的能力，但其输入体内后的激活过程可被肿瘤微环境抑制。为了克服这一限制，研究人员开发出一种共表达MUC16ecto CAR 和IL-12 的构建体（4H11-28z/IL-12）［17］。与4H11-28z CAR-T细胞相比，4H11-28z/IL-12 CAR-T 的增殖能力更强，分泌的干扰素-γ（interferon-γ， IFN-γ）量也更多。在重度联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency， SCID）小鼠上建立肿瘤模型，分泌IL-12 的4H11-28z/IL-12CAR-T 可以提高小鼠的生存率、延长T 细胞作用时间。

2.4 乳腺癌

粘蛋白28z（mucoprotein 28z，MUC28z）是一种嵌合抗原受体，包含TAB004的单链抗体与CD28和CD3ζ偶联。TAB004能识别乳腺癌中异常糖基化的肿瘤形式tMUC1。研究人员用MUC28z 转导人T 细胞［18］，证实MUC28z CAR-T 细胞对一组tMUC1 阳性的患者三阴性乳腺癌细胞具有特异杀伤效果，检测发现MUC28z CAR-T分泌颗粒酶B、IFN-γ、其他Th1型细胞因子和趋化因子的量显著增加。同时，体内实验结果和CAR-T安全性评估也符合预期。因此，靶向tMUC1 的MUC28z CAR-T 细胞对tMUC1 阳性三阴乳腺癌具有很高的治疗潜力。

同样是靶向粘蛋白1（Mucoprotein 1，MUC1），Bajgain 等［19］利用HMFG2 单链抗体构建第一代（（1G-CD3ζ））和第二代（2G-41BB.CD3ζ）MUC1特异性CAR-T 细胞，研究利用肿瘤环境驱动T 细胞活化。为了保护CAR-T 免受肿瘤微环境中免疫抑制性细胞因子的影响，将IL-4受体外域与IL-7受体内域（4/7ICR）连接共表达，以期在富含IL-4 的肿瘤环境中，强化CAR-T 的迁移、增殖能力。1G CAR.MUC1 T 细胞在应对MUCI 阳性乳腺癌细胞表现出以PD-1 和T 细胞免疫球蛋白-3（T cell immunogbulin-3，TIM3）上调为特征的耗尽表型，而在富含IL-4 的背景下，2G CAR. MUC1 和4/7ICR 的共表达促进了转基因细胞T 细胞选择性扩增，并在体内和体外产生有效和持久的肿瘤控制。这证明了使用能够在复杂肿瘤微环境中生长的优化设计的T细胞靶向乳腺癌的可行性。

细胞间质上皮转换因子（cellular-mesenchymal epithelial transition factor， c-Met）具有酪氨酸激酶活性，与癌症发生发展密切相关［20］。当CAR-T疗法应用于临床病人，一项0 期临床试验（NCT01837602）评估了瘤内注射c-Met CAR-T细胞治疗转移性乳腺癌的安全性和可行性［21］。乳腺癌因其病灶位置浅表，成为极少数能试验瘤内注射方式的癌症之一，瘤内注射省去了CAR-T 细胞迁移到肿瘤组织内部的过程，同时减少了CAR-T细胞攻击正常组织的概率。患者接受单次瘤内注射3 × 107或者 3 × 108个细胞，分别在2 例和4 例患者的外周血和注射后的肿瘤组织检测到CAR-T mRNA，部分患者发生不良反应未达1 级。在乳腺肿瘤内注射c-Met CAR-T 细胞具有良好的耐受性并在肿瘤内引发炎症反应。

3 CAR-T细胞用于治疗妇科恶性肿瘤的挑战

3.1 趋向困难

女性高发恶性肿瘤归类于实体瘤，在基础研究中，可以简单将效应细胞与靶细胞共培养以获得良好的杀伤效应。但是临床实际应用，CAR-T需要在人体内突破重重障碍，转运到癌细胞所在的位置与其表面的靶抗原结合才能发挥作用。这些障碍往往是由免疫抑制微环境所主导［22］。实体瘤会分泌一些趋化因子，T细胞上缺乏趋化因子受体，无法与实体瘤分泌的趋化因子，如趋化因子配体1（chemokine ligand1，CXCL1）、趋化因子配体12（chemokine ligand12，CXCL12）和趋化因子配体5（chemokine ligand5，CXCL5）［23-24］等结合，造成向肿瘤病灶的转移过程愈发困难。国内有学者成功制备CXCL13趋化型NKG2D-CAR-T细胞，研究其对骨肉瘤的治疗应用［25］，趋化因子CXCL13 存在于骨肉瘤细胞上，可以促进肿瘤的侵袭与发展，趋化因子受体5（chemokine receptor，CXCR5）是CXCL13 的受体，CXCL13 可以趋化CXCR5 阳性的T 细胞归巢到肿瘤组织发挥作用。与NKG2D-CAR-T 细胞相比，CXCL13-NKG2D-CAR-T 细胞向CXCL13 的趋化能力和对靶细胞的杀伤能力明显增强；与靶细胞共培养后，抗肿瘤细胞因子的分泌量和效应细胞的体外增殖能力都有显著提高。同时，携带了趋化因子受体的CAR-T 细胞在体内存活时间更长，血液中CD8+T 细胞的比例升高，实现更好的肿瘤趋化效果和对肿瘤的抑制能力。

3.2 浸润过程复杂

实体瘤上血管密集［26］，肿瘤相关成纤维细胞和髓样细胞形成细胞外基质（extracellular matrix，ECM）。这些特征成为CAR-T浸润肿瘤微环境的阻碍［27］，即使部分浸润，也会逐渐被浸润的免疫细胞抑制，引发CAR-T细胞无能和耗竭。Adachi等［28］设计并构建了表达IL-7 和趋化因子配体19（chemokine Ligand 19，CCL19）的CAR-T 细胞（7*19 CAR-T细胞），应用后发现机体的树突状细胞和T细胞的浸润增加，比传统CAR-T细胞在抗肿瘤方面更具优势。针对免疫缺陷小鼠的体内实验同样展现7*19 CAR-T细胞抗肿瘤优异的一面。

3.3 抗原特异性

肿瘤特异性抗原（tumor specific antigen， TSA）的缺少也是限制CAR-T 疗法在妇科恶性肿瘤上的临床应用的一个很重要因素。CAR-T 细胞靶向的肿瘤靶标特异性越低，产生严重的不良反应——脱靶效应的可能性就越高。CD19 CAR-T在治疗血液系统恶性肿瘤取得突破性的成功，CD19就是B细胞谱系起源的恶性肿瘤中特异性相对比较高的抗原。因此，CD19 是B 细胞相关恶性肿瘤非常理想的靶标。但是大多数正在进行的CAR-T 细胞治疗实体瘤的临床试验都使用的是肿瘤相关抗原［29］。

4 CAR-T治疗的主要不良反应

4.1 细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome， CRS）

CAR-T 治疗后CRS 总发生率高达78.3%［30］，不得不引起重视。免疫细胞增殖后，大量细胞因子和炎症标志物（IL-6、IL-2、IFN-γ、TNF-α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、T 淋巴细胞巨噬细胞炎症蛋白1α（T lymphocyte macrophage inflammatory protein 1 α，MIP1α）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、IL-5 等）释放入血［31］。CRS 可以导致机体各系统的功能障碍［32］。陈丹等［33］研究小剂量地塞米松预防CD19 CAR-T细胞治疗后严重CRS的临床应用效果，发现早期应用小剂量地塞米松进行预防的组别，在用CD19 CAR-T 细胞治疗后，严重CRS 反应的发生率显著下降。同时观察到，这种预防性的用药措施对CAR-T细胞扩增及治疗结果无明显影响。

4.2 溶瘤综合征

溶瘤综合征，顾名思义与肿瘤细胞破裂相关。CAR-T细胞引起大量肿瘤细胞死亡裂解后，细胞内容物包括尿酸、电解质等，会以较高的浓度释放到血液中，超出了肝脏的代谢能力和肾脏的排泄能力，出现恶心呕吐、嗜睡和心悸等症状，严重时甚至会出现各种危及生命的并发症，如严重心律失常、急性肾功能衰竭、肌肉痉挛等［34］。

4.3 免疫效应细胞相关神经毒性综合征（immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome， ICANS）

ICANS 表现为广泛的神经和认知障碍，从轻微头痛、书写变化到失语症、癫痫、脑水肿，甚至昏迷需要机械通气［35-38］。Holtzman 等［39］收集了用axicabtageneciloleucel 药物（CD19 CAR-T 细胞疗法）治疗复发性/难治性大B 细胞淋巴瘤患者45 例，其中25 例患者出现ICANS，其中18 例患有严重ICANS。这说明ICANS的发生率和伤害性足以引起重视。同时，研究人员的一个关键新发现是基线纤维蛋白原作为ICAN 预测性生物标志物的作用，高纤维蛋白原的患者经过CAR-T 治疗后罹患ICANS的风险更高，并且治疗后纤维蛋白原的水平会有较大幅度的下降。

5 展 望

从技术手段上来说，应该致力于设计改造单一的CAR-T细胞结构，克服CAR-T疗法治疗恶性肿瘤面临的一系列困难；从治疗效果看，应该着力于提高CAR-T疗法的有效性和安全性，规避CAR-T疗法带来的毒副作用。或许随着双特异性CAR-T 细胞［40］、多靶点CAR-T细胞［41］以及CAR-T与其他传统或新兴的抗肿瘤疗法的联合应用的发展，CAR-T在女性高发恶性肿瘤乃至实体瘤方向的治疗水平会进入更广阔的领域。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突