葛根素通过抑制MAPK/NF-κB信号通路调节LPS诱导的人牙髓干细胞的炎症损伤和成骨分化

支旺 温惠慧 崔志强

牙髓炎是由龋齿或外伤引起的牙齿急性或慢性炎症,已成为危害口腔健康的常见病[1]。根管治疗是牙髓炎常用疗法,但易导致牙齿脆性增加并缩短牙齿存活时间[2]。因此,需要开发新方案。细菌感染是牙髓再生过程中的强大障碍。细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可刺激细胞分泌促炎因子,引起牙齿炎症反应[3]。人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)具有治疗牙髓疾病的潜力[4]。但针对炎症条件下hDPSCs修复能力的研究较少。核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路是主要的炎症通路[5-6]。抑制NF-κB和MAPK通路可抑制炎症介质的产生,增强成骨细胞或成牙本质细胞分化,是促进牙髓组织再生的潜在靶点[7]。葛根素(puerarin,PR)具有抗炎和抗菌作用[8]。据报道,PR通过抑制MAPK/NF-κB信号通路抑制破骨细胞生成[9];还可通过p38 MAPK信号通路刺激骨髓间充质干细胞的成骨分化和骨形成[10]。然而,PR对炎症条件下hDPSCs成骨分化的影响及作用机制尚不清楚。因此,本研究旨在探究PR对炎症条件下hDPSCs成骨分化的影响及潜在机制。

1 材料与方法

1.1 hDPSCs分离、培养和鉴定

从健康志愿者(18～25 岁,没有龋齿和炎症)的第三磨牙获得牙髓组织。将牙髓组织切成小块,用2 mg/mL I型胶原酶在37 ℃下消化30 min后,将细胞悬浮在含有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养。 7 d后,细胞成功从牙髓组织中爬出。每3 天更换1 次培养基,培养达到80%融合后,进行传代。将细胞用胰蛋白酶消化2～5 min,然后,以500 g离心5 min,将细胞沉淀重悬于完全培养基中。为了评估细胞活力,将等体积的细胞悬浮液和0.4%台盼蓝混合,并将10 μL制备好的样品装入血细胞计数器的每个腔室中。在制备样品后5 min内对活细胞和非活细胞进行计数。具有超过90%存活率的细胞悬液以1∶3的比例进行传代培养(第1 代)。取第4 代细胞用于实验。

通过流式细胞术评估hDPSCs的表面标志物。用0.25%胰蛋白酶消化细胞并与以下抗体在室温下避光孵育30 min:抗CD34-PE、抗CD45-PE、抗CD29-PE、抗CD90-PE、抗CD105-PE和抗CD146-PE。将细胞重悬后使用流式细胞仪分析。

1.2 主要试剂与仪器

PR(纯度≥98.0%)、SB203580(p38 MAPK抑制剂)(82435、S8307,Sigma-Aldrich,美国);LPS、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性检测试剂盒(L8880、BC0685,北京Solarbio公司);碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)测定试剂盒(A059-2-2,南京建成);一抗:p-NF-κB p65(Ser536,#3033)、NF-κB p65(#8242)、p-IκBα(Ser32/36,#9246)、IκBα(#4814)、p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182,#4511)、p38 MAPK(#8690)(Cell Signaling Technology公司,美国)。FACScan流式细胞仪(BD Biosciences公司,美国);ABI Prism®7500型荧光定量PCR仪(应用生物系统公司,美国)。

1.3 CCK-8法检测PR对hDPSCs增殖活力的影响

将2×103个细胞/孔接种在96 孔板中并孵育过夜。然后,将细胞暴露于含有10、20、40和80 μmol/L PR或对照(对照,DMSO)的DMEM培养基中。培养1、 3、 5 d后,每孔加入10 μL CCK-8工作液(5 mg/mL),继续培养2 h;使用酶标仪在450 nm处测量每个孔的吸光度值(A值)。

1.4 LDH测定法评估PR对LPS诱导的hDPSCs细胞毒性

将2×104个细胞/孔接种在24 孔板上并培养过夜,分为:对照组、LPS组、SB203580组(20 μmol/L)[11]、20 μmol/L PR组、40 μmol/L PR组、PR+SB203580组(40 μmol/L PR+20 μmol/L SB203580),除对照组外,其余各组将1 μg/mL LPS添加到hDPSCs的培养基中以模拟hDPSCs炎症[12]。在用LPS处理前,SB203580组用0.5 ng/mL SB203580处理24 h;PR各剂量组用20、40 μmol/L PR处理24 h,PR+SB203580组用PR和SB203580共同处理24 h。然后,收集细胞并取无细胞上清液,按照试剂盒说明检测LDH活性。

1.5 茜素红染色检测hDPSCs成骨分化能力

hDPSCs以1×104个/孔的密度接种于24 孔培养板内,按照“1.4”项下方法进行分组与处理,然后与成骨分化培养基一起培养14 d,每2 天更换一次成骨分化培养基。 14 d后,将细胞用4%多聚甲醛固定、2%茜素红染色。显微镜下观察矿化结节形成情况并拍照,并采用10%氯化十六烷基吡啶溶解矿物质沉积物,在562 nm处测量A值来量化染色强度。

1.6 ALP活性测定

hDPSCs按照“1.5”项下方法进行分组与处理,在诱导成骨分化第7 d,弃去培养液,使用0.1% Triton X-100裂解细胞,将细胞裂解上清液加入96 孔板(50 μL/孔)中,使用ALP活性检测试剂盒测定ALP活性。

1.7 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α和RUNX2、OCN、BSP表达

使用Trizol试剂从细胞中提取总RNA。然后将提取的RNA逆转录为cDNA。SYBR Premix EX Taq用于定量基因表达。RT-qPCR条件包括在95℃下3 min的初始变性,然后是95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s的40 个循环。引物序列见表1。采用2-ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达量,用GAPDH对靶基因表达进行标准化。

表1 用于RT-qPCR的引物序列Tab 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.8 Western blot检测细胞中MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达

收获hDPSCs,RIPA裂解液提取总蛋白,并使用BCA法进行定量。将蛋白质样品(20 μg)通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离,然后转移到PVDF膜上。将膜用5%脱脂牛奶封闭1 h,然后与以下一抗4℃孵育过夜:p-IκBα(1∶500)、IκBα(1∶500)、 p-NF-κB p65(1∶1000)、NF-κB p65(1∶1000)、p-p38 MAPK(1∶1000)、p38 MAPK(1∶1000)和GAPDH(1∶2000)。次日,将膜与羊抗兔IgG二抗(1∶2000)在室温下孵育1 h。ECL试剂显影蛋白质条带,Image J软件用于分析灰度值以量化结果。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 hDPSCs的表型鉴定

流式细胞仪检测结果显示,hDPSCs表达特异性间充质干细胞抗原CD29、CD90、CD105和CD146阳性,而造血细胞抗原CD45和CD34均为阴性(图1)。

图1 hDPSCs的表型Fig 1 Phenotype of hDPSCs

2.2 PR对hDPSCs增殖活力的影响

在第3、5 天,与对照组相比,20、40 μmol/L PR处理时hDPSCs增殖活力显著增加(P<0.05),而80 μmol/L PR组hDPSCs增殖活力差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。因此,后续实验选择20和40 μmol/L的PR。

表2 各组hDPSCs增殖活力比较Tab 2 Comparison of the proliferation activity of hDPSCs in the groups n=6)

2.3 PR对LPS诱导的hDPSCs细胞毒性的影响

与对照组相比,LPS组hDPSCs中LDH活性显著升高(2.42±0.31比1.00±0.00,P<0.05);与LPS组相比,20 μmol/L PR组、40 μmol/L PR组和SB203580组LDH活性显著降低(1.98±0.25、1.61±0.22、1.59±0.20比2.42±0.31,P<0.05);与SB203580组、40 μmol/L PR组相比,PR+SB203580组LDH活性显著降低(1.20±0.17比1.59±0.20、1.61±0.22,P<0.05)。

2.4 PR对LPS诱导的hDPSCs成骨分化能力的影响

与对照组相比,LPS组hDPSCs中矿化结节数量明显减少,染色强度和ALP活性显著降低(P<0.05);与LPS组相比,20 μmol/L PR组、40 μmol/L PR组和SB203580组矿化结节数量明显增加,染色强度和ALP活性显著升高(P<0.05);与SB203580组、40 μmol/L PR组相比,PR+SB203580组矿化结节数量明显增加,染色强度和ALP活性显著升高(P<0.05)(图2～3)。

2.5 PR对LPS诱导的hDPSCs中成骨分化相关基因表达的影响

与对照组相比,LPS组hDPSCs中RUNX2、OCN、BSP的mRNA水平显著降低(P<0.05); 与LPS组相比,20 μmol/L PR组、 40 μmol/L PR组和SB203580组RUNX2、OCN、BSP的mRNA水平显著升高(P<0.05);与SB203580组、 40 μmol/L PR组相比,PR+SB203580组RUNX2、OCN、BSP的mRNA水平显著升高(P<0.05)(图4)。

与对照组相比,*P<0.05;与LPS组相比,#P<0.05;与40 μmol/L PR组相比,&P<0.05;与SB203580组相比,△P<0.05, n=6(图5同)图4 各组hDPSCs中RUNX2、OCN、BSP、IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA水平Compared with the Control group, *P<0.05; compared with the LPS group, #P<0.05; compared with the 40 μmol/L PR group, &P<0.05; compared with the SB203580 group, △P<0.05, n=6(the same to fig 5)Fig 4 mRNA levels of RUNX2, OCN, BSP, IL-6, IL-1β and TNF-α in hDPSCs in the groups

2.6 PR对LPS诱导的hDPSCs中炎症相关基因表达的影响

与对照组相比,LPS组hDPSCs中IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,20 μmol/L PR组、 40 μmol/L PR组和SB203580组IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA水平显著降低(P<0.05);与SB203580组、 40 μmol/L PR组相比,PR+SB203580组IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA水平显著降低(P<0.05)(图4)。

2.7 PR对LPS诱导的hDPSCs中MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

与对照组相比, LPS组hDPSCs中IκBα蛋白水平显著降低,p-IκBα蛋白水平和p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值显著升高(P<0.05);与LPS组相比,20 μmol/L PR组、40 μmol/L PR组和SB203580组IκBα蛋白水平显著升高,p-IκBα蛋白水平和p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值显著降低(P<0.05);与SB203580组、40 μmol/L PR组相比,PR+SB203580组IκBα蛋白水平显著升高,p-IκBα蛋白水平和p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值显著降低(P<0.05)(图5)。

图5 各组hDPSCs中MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达Fig 5 Expression of MAPK/NF-κB signaling pathway-related proteins in hDPSCs in the groups

3 讨 论

LPS为革兰氏阴性菌外膜的主要成分,可减弱hDPSCs的成牙/成骨分化[12-13],常被用于在体外建立炎症微环境模型[12]。本研究采用1 μg/mL LPS刺激hDPSCs模拟体外炎症微环境,探索PR在体外的抗炎和成骨分化功能。结果显示, 当用LPS刺激hDPSCs时,炎性细胞因子(包括IL-6、TNF-α、IL-1β)的表达与对照组相比增加,这与先前的研究一致[13]。而PR处理可降低LPS诱导的细胞毒性,并下调促炎基因表达。据报道,PR可抑制破骨细胞激活因子TNF-α、IL-1β和前列腺素E2,防止LPS诱导的破骨细胞形成、功能和骨质流失[14],并可抑制LPS诱导的人脐静脉内皮细胞中NF-κB活化来预防血管内皮损伤[15];这些发现进一步支持了本研究结果。提示,PR可减少LPS诱导的hDPSCs炎症反应。

促进炎症微环境下hDPSCs的成骨分化是调节牙髓炎症和促进牙髓修复的关键。因此,本研究进一步探讨了PR对炎症状态下hDPSCs成骨分化能力的影响。结果显示,PR改善了LPS诱导的hDPSCs中成骨分化相关基因表达的降低,增强了ALP活性,并增加了矿化结节的形成。表明PR可促进hDPSCs在炎症环境中的成骨分化。提示,PR可促进炎症状态下hDPSCs的细胞分化和再矿化过程,可能是炎症条件下牙髓组织再生的潜在治疗剂。

PR在抑制LPS诱导的hDPSCs炎症方面显示出明显的优势,但其机制尚不完全清楚。本研究试图探究PR发挥作用的相关信号通路。已知LPS诱导的炎症反应可由细胞内MAPK/NF-κB信号通路的激活介导[5-6]。NF-κB途径涉及IκBα的磷酸化和随后的降解,可诱导NF-κB p65亚基的核转位和NF-κB依赖性基因表达。研究表明,抑制NF-κB和MAPK信号可以抑制炎症因子的产生,改善hDPSCs的成牙/成骨分化的潜力[16]。在本研究中,PR处理减少了IκBα的磷酸化降解,抑制了NF-κB的活化并降低了LPS刺激的hDPSCs中p38 MAPK的磷酸化水平;且40 μmol/L PR与SB203580对MAPK信号通路的抑制作用接近,两者联用对MAPK/NF-κB信号通路的抑制作用和炎症状态下hDPSCs成骨分化的促进作用明显优于两者单独应用。提示,PR对LPS诱导的hDPSCs抗炎作用可能与抑制MAPK/NF-κB信号通路有关。

综上所述,PR可减轻LPS诱导的hDPSCs炎症损伤,促进炎症状态下hDPSCs成骨分化;其作用机制可能与抑制MAPK/NF-κB信号通路有关。但仍有一些问题需要在以后的实验中深入分析:(1)将考察PR在牙髓中其他细胞系中的抗炎作用,以综合评价PR控制炎症和组织再生的作用;(2)将建立体内模型,阐明PR的抗炎和促进成骨分化作用,并确定体内应用的最佳浓度。