玉米杂交种泛玉398 及其亲本指纹图谱构建

徐运峰，韦胜利

（1. 河南黄泛区地神种业农科院，河南 周口 466632；2. 河南黄泛区地神种业有限公司，河南 周口 466632）

玉米不仅是我国重要的粮食作物［1］，还被广泛用于工业酒精制造、动物饲料等多种方面，在农业生产中具有举足轻重的地位。玉米杂交种和亲本遗传真实性是种子质量的重要标志之一，直接影响着玉米生产的产量和质量［2］。近几年来，粮食安全问题被愈加重视，随着我国玉米种植面积不断扩大，除了各省种子管理站的官方审定渠道，各地玉米联合体和“绿色通道”等审定渠道不断增加，玉米新品种数量也呈现“井喷式”增长，并且这种情况还在愈演愈烈。而今品种间很难区分［3］，认为是相同或相似品种而被叫停或者终止试验的现象时有发生，主要原因可能是种质资源有限，已有自交系只是简单的被集中、反复使用，新选出的自交系同质化严重，从而导致一些选配玉米新品系农艺性状相似，田间表型趋同，DNA 指纹分析位点差异小。品种田间农艺性状的表现、种子方面的性状表现等传统的品种鉴定方法不但费时、费力，而且还易受环境条件影响，已然不能精准鉴定。

简单序列重复长度多态性（SSR）标记因具有共显性、多态性高、分型技术简便快捷、成本低等优点，能够快速、准确、有效地鉴定玉米杂交种和自交系的真实性，近些年来被广泛应用在玉米品种标准DNA指纹图谱构建和检测中［4-11］。如李丽华等［6］利用9对SSR 核心引物对20 个玉米自交系进行了指纹图谱构建；高玉倩等［10］采用20 对SSR 核心引物对2005—2009 年吉林省审定玉米品种进行了指纹图谱构建及分析；周联东等［11］采用6 对SSR 核心引物对玉米品种沃玉964 进行了指纹图谱构建及分析。

玉米杂交种泛玉398 是由河南黄泛区地神种业有限公司育成，于2021 年通过河南省审定的抗病、抗倒、高产、适应性广、年份间田间表现稳定的中晚熟品种，审定编号为豫审玉20210030。本研究基于SSR分子标记技术，利用40 对玉米核心引物对泛玉398 及其亲本进行分析，筛选出条带清晰、亲本互补的引物，用来构建泛玉398 及其亲本的指纹图谱，以期为准确、有效地鉴定市场流通的泛玉398 杂交种的真实性提供支持，进而保障该品种的顺利推广。

1 材料和方法

1.1 供试材料与药品试剂

供试材料为玉米杂交种泛玉398 及其母本A552、父本B13，均由河南黄泛区地神种业有限公司提供。试验所用CTAB、2×PCR Mix、硝酸银、丙烯酰胺等药品购买于上海生工股份有限公司。SSR 分析中所用40 对玉米核心引物由上海生工股份有限公司合成，其序列来自玉米基因组数据库（http：//www.maizegbd.org/ssr.php）。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取 玉米品种泛玉398 杂交种及其母本A552、父本B13 种子于28 ℃培养箱中暗培养，于三叶一心期取至少20 棵单株叶片混样，用CTAB 方法提取其总DNA［12］，加适量TE 缓冲液溶解，剩余样品放4 ℃冰箱备用。

1.2.2 PCR 扩增及电泳分析 PCR 扩增总体积为15.0 μL，包括2×PCR Mix 7.5 μL、DNA 模板1.0 μL、引物1.0 μL、灭菌水5.5 μL。扩增程序：94 ℃预变性6 min；94 ℃变性40 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环；72 ℃终延伸10 min［13］。将1.0 μL 上样缓冲液加入PCR 扩增产物中并混匀，用移液枪吸取2.5 μL 样品于8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中上样，电压150 V 分离检测扩增产物。凝胶用银染法显色，在胶片观测灯上观察分析电泳结果。

1.2.3 泛玉398 指纹图谱构建及其图谱数字化 根据上述电泳分离结果，筛选出条带重复性好、清晰，且亲本互补的引物，用来构建玉米杂交种泛玉398 及其亲本的指纹图谱。同时，用数字“0”和“1”表示在相同迁移率位置条带的“无”和“有”2 种情况，将指纹图谱数字化。并根据公式P=1/2n计算出现相同指纹的概率。

2 结果与分析

2.1 SSR 引物筛选及泛玉398 指纹图谱构建

利用40 对玉米核心引物对玉米杂交种泛玉398及其亲本进行扩增，结果表明，筛选出6 对条带清晰且亲本条带互补的引物，用来构建泛玉398 及其亲本的指纹图谱（图1）。这6 对引物分布在玉米的4 条染色体上，分别是bnlg439w1、umc2015k3、umc1705w1、bnlg291k4、umc1147y4、bnlg1671y17，共检测出24 个等位基因，平均每对引物检测出4 个等位基因，这些等位基因片段大小在100～500 bp（表1）。这6 对引物所构建的泛玉398 及其亲本的指纹图谱条带分离良好、清晰稳定、重复性好，可用来鉴定玉米杂交种泛玉398 及其亲本的真实性。

表1 用于构建泛玉398 指纹图谱的引物信息

图1 筛选出的6 对引物对泛玉398 及其亲本的扩增产物

2.2 指纹图谱数字化

用数字“1”和“0”将以上6 对引物所构建的指纹图谱数字化，并利用公式P=1/2n计算出出现相同指纹的概率为5.96×10-8（表2），概率极低。表明本研究所构建的杂交种泛玉398 及其亲本的指纹图谱可用来鉴定玉米杂交种泛玉398 的真实性。

表2 杂交种泛玉398 及其亲本的数字化指纹

3 结论与讨论

玉米是我国重要的粮饲作物，关系到国民经济的战略资源。巨大的市场需求量，使得玉米杂交种具有较高的商业化程度，而在利益的驱使下，假劣玉米种子频现［14］，玉米杂交种的真实性鉴定显得至关重要。目前，分子标记技术主要用于玉米的遗传多样性分析、杂种优势群划分、主要性状的QTL 定位、关联分析、指纹图谱构建、种子纯度鉴定等方面。SSR技术多态性丰富，呈共显性，可以区分纯合与杂合基因型，对DNA 数量及质量要求低，操作简单，结果重复性好，是目前玉米种子真实性和纯度鉴定中较为常用的技术之一［13］。

本研究利用40 对玉米核心引物对泛玉398 进行SSR 分子标记技术分析，筛选出6 对条带互补的引物，构建玉米杂交种泛玉398 及其亲本的指纹图谱。同时，为更加直观地将结果呈现出来，将所构建指纹图谱数字化，并通过计算，得出出现相同指纹的概率极低，增加了可信程度，说明这6 对引物可用来鉴定杂交种泛玉398 的真实性。生产实践中，可从中选2～3 对引物用于杂交种泛玉398 的真实性鉴定，操作简单，不受大田环境影响，结果可靠。本研究为更好地保护玉米新品种泛玉398 及其亲本提供了参考依据。