Box-Behnken响应面法优化枫香树叶总酚酸提取工艺
2023-11-04周燕霞雷英乐志艳
周燕霞,雷英,乐志艳
(江西医学高等专科学校 药学院,江西 上饶 334000)
枫香树叶(Liquid-ambarformosanaHance)为金缕梅科枫香属植物枫香的干燥叶片,早在《唐本草注》《南方草木状》《蜀本草图经》《本草纲目》等均有记载,现收载于《江西省中药材标准》(1996年版)[1]。枫香树叶多在秋天采收,性辛;味苦;有小毒,归脾;肾;肝经,具有清热解毒、祛风除湿、行气止痛、消炎杀菌之功效,主要用于治疗急性胃肠炎、痢疾、痈肿疮疡、产后风、小儿脐风、创伤出血等病症[2-3]。化学成分研究显示,枫香树叶中主要含有酚酸、黄酮、挥发油、萜类以及黑色素等成分[4-8],其中酚酸类成分主要包括没食子酸、没食子酸乙酯、原儿茶酸等,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗突变、抗自由基、保护肝脏等多种生物学活性[9],已广泛应用于医药化工、食品生物等领域,也可能是枫香树叶发挥消炎杀菌、行气止痛作用的主要有效成分。目前,对于枫香树叶中酚酸类成分的研究报道相对较少,仅有学者对枫香树叶中没食子酸的含量进行了测定研究[10],对其酚酸类成分的提取工艺及药理活性研究还未见报道。Box-Behnken响应面法是一种通过非线性数学模型连续对实验的各个水平进行综合试验设计,再通过对回归方程的精确分析以寻求最优工艺参数的优化方法,可有效考察影响因素之间的交互作用,具有试验次数少、周期短、精密度高、预测性能好等优点,被广泛用于中药有效成分的提取工艺优化[11]。为进一步深入研究枫香树叶中酚酸类成分的开发价值,本研究以总酚酸的含量为评价指标,采用Box-Behnken响应面法筛选枫香树叶总酚酸的最佳提取工艺,以期为枫香树叶质量评价、药理作用、资源开发等研究提供依据。
1 仪器与试药
HAD-752N型紫外分光光度计(日本岛津公司);KQ5200B型超声机(昆山超声仪器公司);MeilenMCS220型电子天平(深圳美孚电子科技有限公司);RT-08型粉碎机(北京开创同和发展有限公司);EPED-10TH超纯水仪(易普易达科技发展有限公司)。对照品没食子酸(批号111081-20191102,纯度99.2%)购自曼斯特科技有限公司。枫香树叶药材购买于揭阳中药市场,经江西医学高等专科学校中药鉴定教研室黄平药师鉴定为金缕梅科枫香属植物枫香树(Liquid-ambarformosanaHance)的干燥叶,无水乙醇、三氯化铁、浓盐酸均为分析纯,水为去离子水。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的没食子酸对准品5.0 mg,加入到100 mL容量瓶中,加入无水乙醇至刻度线,配成质量浓度为50 μg/mL的标准品溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备
精密称取粉碎后的枫香树叶1.0 g,置50 mL的具塞锥形瓶中,加入一定量的提取溶剂,在一定条件下超声提取,过滤,定容至50 mL,取1 mL滤液置100 mL容量瓶中,定容,得供试品溶液。
2.1.3 标准曲线的绘制
参照文献[12],精密吸取上述配置质量浓度50 μg/mL的没食子酸标准溶液0,0.25,0.50,1.00,2.50,5.00,10.00 mL分别置于25 mL的容量瓶中,分别依次加入4.0 mL的无水乙醇溶液、2.0 mL的0.3%十二烷基硫酸钠以及1.0 mL的0.6% FeCl3和0.9%K3[Fe(CN)6]的混合溶液,摇匀,在黑暗处放置5 min,随后再加入0.1 mol/L的HCl至刻度,摇匀显色,继续在黑暗处放置20 min后,在最大吸收波长720 nm处测定吸光度,设置空白对照。以没食子酸浓度C为横坐标,吸光度A为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程A= 0.264 7C+0.015 2(R2= 0.999 5),表明没食子酸在质量浓度为0.50～20.0 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。
2.2 工艺的优化
2.2.1 单因素考察
以枫香树叶总酚酸得率为评价指标,分别对不同的提取溶剂浓度(50%,60%,70%,80%,90%乙醇),不同的提取时间(30,45,60,75,90 min),不同的提取温度(40,50,60,70,80 ℃),不同的液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)进行考察比较。结果显示,在60%乙醇浓度、45 min的提取时间,60 ℃的提取温度,25∶1的液料比条件下枫香树叶总酚酸的提取效率最佳。
2.2.2 响应面设计
在单因素试验的基础上,选择乙醇浓度、提取时间、提取温度、液料比4个因素为指标,采用Box-Behnken软件设计提取条件。具体的因素水平表见表1,中心组合设计和所得结果见表2。
表1 Box-Behnken方案设计因素和水平
表2 响应面试验设计与结果
2.2.3 方差分析
采用Design-Exper8.0.6软件对表2中的数据进行多元回归拟合分析,得枫香树叶总酚酸对乙醇浓度、提取时间、提取温度、液料比的二项多次回归模型方程为:Y=0.26+0.026A+0.016B+0.027C+0.016D-0.003 5AB-0.015AC-0.026AD-0.007 2BC-0.009 7BD-0.02CD-0.024A2-0.03B2-0.042C2-0.016D2。式中Y代表枫香树叶总酚酸得率。详细的分析及方差结果见表3。由表3的结果可知,本试验所建立的Box-Behnken响应面模型P=0.007 1,呈现出极显著水平,失拟误差P=0.176 2,呈不显著水平,说明拟合较好,模型可靠,能较好地反映出枫香树叶总酚酸得率与乙醇浓度、提取时间、提取温度、液料比的关系。单因素中乙醇浓度和提取温度对总酚酸的影响最大,二次项中B2和C2的P值分别为0.017 8,0.002 1,均<0.005,呈现出显著的水平,表明所建立的模型能够较好地预测枫香树叶总酚酸含量与各参数之间的变化关系。
表3 模型各项的方差分析结果
2.2.4 响应面分析因素之间交互作用
根据上述模型方差分析结果及回归方程,绘制Box-Behnken响应面图,结果如图1所示。结果显示,枫香树叶总酚酸的最佳提取工艺参数为:乙醇浓度66.7%、提取时间49.9 min、提取温度62.5 ℃、液料比23.4,总酚酸的预测得率为0.183%。
图1 各因素之间的响应面图
2.2.5 最佳提取工艺及试验验证
取枫香树叶3份,每份约1.0 g,根据优化所得的最佳提取工艺进行提取。考虑到实际的可操作性,将上述优化得到的提取条件修正为:乙醇浓度67%、提取时间50 min、提取温度63 ℃、液料比25,总酚酸的得率为0.187%,与预测得率0.183%较为接近,无显著性差异,表明所建立的模型可行、所得的结果可靠。
3 小结
枫香树叶具有清热解毒、消炎杀菌、消肿止痛等多种功效,且入药后有浓郁的香气,既可以捣烂或研成粉末后可直接泡水饮用,还可作为临床常用中成药肠炎宁片的主要组成药,是一味药效确切、价值较高的中药材。近年来,关于枫香树叶的研究越来越多,但主要集中在药理作用、化学成分、含量测定等方面[13-14],关于酚酸类成分的提取分离和工艺优化研究还相对较少,有待于进一步研究探讨。本试验采用Box-Behnken响应面法,在通过单因素确定影响枫香树叶总酚酸提取主要因素的基础上,选择乙醇浓度、提取时间、提取温度、液料比4个因素为指标,建立了枫香树叶总酚酸提取工艺优化的Box-Behnken中心组合设计,最终优化得到枫香树叶总酚酸的最优工艺参数为:乙醇浓度60%、液料比21∶1、超声时间47 min,此条件下枫香树叶总酚酸的提取率为96.78 μg/g,与预测值96.67 μg/g接近,无显著性差异,表明方法可行,可为枫香树叶资源的进一步开发利用提供理论依据。
