HBV相关肝细胞癌患者血清miR-504、miR-200a、IL-24水平及其与肝癌的相关性

成晓梅 田红 李想 杨洁

我国乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染患者较多,部分HBV感染者可能进展为乙型肝炎肝硬化,甚至进展为HBV相关性肝癌[1]。由于肝癌的早期诊断缺乏灵敏度、特异度高的生物学指标,很多患者在进行腹部CT检查时已进展至肝癌晚期,严重影响患者生存率及生活质量,因此早期诊断及治疗尤为重要[2]。随着外科手术技术、小分子靶向药物及生物制剂的不断发展,肝细胞癌患者可选择的治疗手段及药物有所增加,但治疗后的复发率、转移率较高,因此早期诊断HBV相关性肝癌并进行干预是提高患者生存率的关键[3]。微小RNA(miR)是一类内源性非编码RNA,已被发现在多种细胞生理活动及肿瘤发生、发展过程中具有重要调节作用[4]。研究发现,miR-200a、miR-504在原发性肝癌患者的组织、血清中表达水平均有变化,且主要发挥抑制肿瘤细胞增殖、侵袭的作用[5-6]。白细胞介素(IL)作为一类炎症因子,在机体内参与多种免疫、炎症、应激等过程,其中IL-24作为一种多效性免疫调节因子,对乳腺癌、食管癌等癌细胞均具有促凋亡及抑制细胞增殖的作用[7-8]。本研究探究HBV相关肝细胞癌患者血清miR-504、miR-200a、IL-24水平特征及与肝癌发生的相关性。

资料与方法

一、研究对象

选取2020年2月至2023年2月于空军第986医院接受治疗且符合纳入、排除标准的HBV相关肝细胞癌患者作为观察组(n=60),另外选取同期慢性HBV感染者作为对照组(n=60)。纳入标准:①符合《原发性肝癌诊疗指南(2022年版)》中肝细胞癌的临床诊断标准[9];②有明确的HBV感染史、家族史及HBV相关病原学检验结果;③均为首次临床诊断肝细胞癌,入组前未接受任何化疗、放疗或手术治疗;④患者一般状况尚好且临床资料完整可取。排除标准:①合并任何其他类型的急、慢性感染;②合并严重心、肺功能障碍或衰竭;③入院治疗前1个月内接受过激素、免疫调节剂等药物治疗;④合并其他类型、部位的恶性肿瘤或存在肝内及全身肝癌转移;⑤同时参与其他临床研究。观察组中男性47例,女性13例,年龄为(59.5±4.0)岁。对照组中男性49例,女性11例,年龄为(58.9±4.7)岁。两组患者性别、年龄及基础疾病的差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究已通过医院伦理委员会审批,所有入组患者均签署知情同意书。

二、方法

(一)一般资料 通过门诊及住院病历系统收集患者ALT、AST、肝功能Child-Pugh分级、HBeAg、HBV DNA等一般资料。

(二)血清miR-504、miR-200a水平检测 通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定患者外周血清miR-504、miR-200a水平。所有患者均于入院时采集空腹外周血5 mL,于室温下以1500 r/min、有效半径10 cm、离心15 min,获得上层血清,使用血清总RNA提取试剂盒(上海沪震实业有限公司)提取血清样本中总RNA,使用多重PCR扩增试剂盒(天根生化科技有限公司)扩增总RNA,应用反转录试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)将总RNA反转录为cDNA,所有步骤均按照对应商品试剂盒说明书操作。应用朗基Q2000B-实时荧光定量PCR仪(苏州阿尔法生物实验器材有限公司)及miScript SYBR Green PCR试剂盒(德国QIAGEN公司)对miR-504、miR-200a及U6内参进行扩增,引物序列见表1。qRT-PCR每孔反应体系为20 μL,包括样本cDNA 2 μL、miScript SYBR Green Mix 10 μL、正向、反向引物各0.8 μL、ddH2O 6.4 μL。表1中所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。qRT-PCR反应体系为95℃,8 min;95℃,20 s;59℃,30 s;72℃,30 s,采集信号,共35个循环。每份样品均设置3个重复孔,通过2-△△CT法计算患者血清中miR-504及miR-200a的相对表达水平。

表1 目标基因及内参基因引物序列

(三)血清IL-24水平检测 应用IL-24 ELISA试剂盒(上海联祖生物科技有限公司),经过上样、孵育、洗板、加酶、孵育、再次洗板、显色、终止等步骤,最终在IO-RAD全自动酶标仪(美国伯乐有限公司)上读取各样本中吸光度(A值),并根据试剂盒中标准品绘制的标准曲线计算出各血清样本中IL-24的表达水平。

三、统计学分析

结 果

一、两组患者一般资料对比

观察组患者HBV DNA高于对照组 (P<0.05),ALT、AST、肝功能Child-Pugh分级及HBeAg阳性率两组差异无统计学意义 (P>0.05),见表2。

表2 两组患者一般资料对比

二、两组患者血清miR-504、miR-200a及IL-24水平对比

观察组患者血清miR-504、miR-200a及IL-24水平均显著低于对照组患者(P<0.05),见表3。

表3 两组患者血清miR-504、miR-200a及IL-24水平对比(±s)

三、观察组患者血清miR-504、miR-200a与IL-24的相关性

Pearson相关性分析表明,观察组患者血清中IL-24水平与血清miR-504呈显著正相关性(r=0.423,P=0.001),与miR-200a水平无明显相关性(r=0.173,P=0.187),见图1。

图1 观察组60例患者血清miR-504、miR-200a与IL-24的相关性

四、HBV慢性感染者血清miR-504、miR-200a、IL-24水平与肝癌发生的相关性

Spearman相关性分析表明,HBV慢性感染者血清miR-504、miR-200a、IL-24水平与肝癌发生呈显著负相关(r=-0.689、-0.383、-0.579,P=0.001、0.001、0.001)。

五、影响HBV慢性感染者肝癌发生的危险因素

二元logistic回归分析表明,HBV慢性感染者血清miR-504、miR-200a及IL-24水平降低均是肝癌发生的独立危险因素(P<0.05),见表4。

表4 影响HBV慢性感染者肝癌发生的危险因素

六、血清miR-504、miR-200a与IL-24水平对HBV慢性感染者肝癌发生的诊断价值分析

ROC分析表明,HBV慢性感染者血清miR-504、miR-200a与IL-24水平诊断肝癌发生的AUC分别为0.898(95%CI:0.839～0.956,P<0.01)、0.721(95%CI:0.630～0.812,P<0.01)及0.834(95%CI:0.762～0.906,P<0.01)。

讨 论

HBV相关肝癌患者早期症状隐匿、病情进展较快,多数患者在出现严重症状及体征时已处于肝癌晚期或存在肝内、肝外多发转移[10]。早期发现并进行外科手术干预可提高肝癌患者的生存率,对于HBV相关肝细胞癌患者,即使应用小分子靶向药物、免疫制剂等仍难以取得良好的临床效果。目前,临床尚缺乏用于肝癌患者早期诊断的特异性标志物。miRNA在多种肿瘤细胞中发挥不同调节功能,其中miR-504、miR-200a等在肺癌、宫颈癌等肿瘤发生、发展过程中发挥抗肿瘤细胞增殖作用,因此被认为是重要的抗肿瘤调节因子[11,12]。此外,IL-24作为一个凋亡调节因子,对多种肿瘤细胞的促凋亡作用也逐渐受到关注[13]。

miR-200a是miR-200家族中的重要成员,其对于子宫内膜异位症具有重要调节作用。miR-200a转录或表达水平降低后会降低对下游Rho激酶的抑制作用,进而促进Rho/Rho激酶通路活化、肌动蛋白收缩及应力纤维合成,最终有利于肿瘤细胞的转移及侵袭,提示miR-200a具有一定抑癌作用[14]。miR-504在胃癌患者肿瘤组织中表达水平较高,且可能通过靶向RNA结合基序蛋白4促进抑制胃癌细胞凋亡进而加重疾病进展,但在胶质母细胞瘤中miR-504表达增高会抑制肿瘤细胞的侵袭及上皮间质转化,且miR-504水平较低的患者生存时间较久,提示miR-504在不同类型肿瘤细胞中可能发挥不同作用[15]。IL-24是IL-10家族成员之一,广泛分布于人体多种细胞、组织中,参与调节细胞的分化及凋亡过程。体外研究发现IL-24可促进结肠癌细胞的凋亡水平,同时能够通过干扰肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞信号传递等方法抑制肿瘤生长及转移[16]。在本研究中,HBV相关肝细胞癌患者血清miR-200a、miR-504及IL-24的表达水平均较低,且是HBV慢性感染者肝癌发生的危险因素,其中血清miR-504对肝癌发生的诊断价值最高。不同的miRNA可能通过调节肝癌发生、发展过程中的不同信号通路及关键节点直接或间接调控肿瘤细胞的增殖、转移及凋亡等过程,miR-504、miR-200a可能通过影响磷脂酰肌醇3激酶通路、Notch通路等方式促进了肝癌细胞凋亡水平[17]。miR-504可能在HBV相关性肝癌早期抑制肝癌细胞的增殖及迁移作用,随着患者HBV慢性感染加重及免疫功能缺损,miR-504表达水平呈下降趋势并失去了对肝癌细胞的抑作用,表现为肝细胞癌患者体内低水平miR-504状态。此外,miR-504可靶向抑癌基因p53,进一步说明了在HBV慢性感染者中miR-504降低与肝癌的发生具有相关性[18]。miR-504与IL-24表达水平具有一定正相关性,提示IL-24可能也在HBV相关肝癌的发生、发展过程中发挥抗癌特性。此外,IL-24也具有一定直接杀伤肿瘤细胞的作用,可作为免疫、炎症调节因子在局部发挥直接抗肿瘤效应。因此,IL-24水平降低可能减弱巨噬细胞、自然杀伤细胞对肝癌细胞的杀伤作用,使机体免疫监视及免疫清除功能降低。但关于miR-504、miR-200a及IL-24可能发挥抗肝癌细胞作用的具体方式仍需进一步通过体外细胞实验或动物模型进行探索。

综上所述,HBV相关肝细胞癌患者血清miR-504、miR-200a、IL-24水平显著降低,与HBV慢性感染者肝癌发生呈负相关,对于HBV相关肝细胞癌具有一定诊断价值。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。