贵州省正安县不同养殖模式下鸡H5、H7 和H9 亚型禽流感血清学调查

何 娅，钱 林，邓位喜，王 娜，周 林，杨玉能，鲍 娟，孙宝盛，代佳娣，经有林

（1.贵州省正安县农业农村局，贵州遵义 563499；2.遵义职业技术学院，贵州遵义 563000）

禽流行性感冒（Avian influenza，AI）俗称禽流感，病原为正黏病毒科的禽流感病毒，其毒力因子除HA 和NA 外，还包括NP基因及聚合酶基因等表达产物的综合作用［1］。未裂解的HA 无感染性，只有在靶器官呼吸道及肠道组织相应的蛋白酶作用下，HA 裂解为HA1 和HA2，暴露融合肽段，通过融合进人宿主细胞。已知高致病力毒株与低致病力毒株的H 裂解位点的氨基酸序列有差异，前者为－XX－精氨酸－X－精氨酸/赖氨酸－精氨酸－（X 为非碱性氨基酸），而低致病力毒株仅有单个精氨酸，切割率极低，不易裂解。能否裂解和融合不仅取决于毒株和组织，也与宿主种类有关。

分离的H5 亚型高致病性毒株对家养鸭、鹅及野生雁和天鹅等也具有强致病性［2］。除HA 富含碱性氨基酸之外，NA 茎部26 个氨基酸缺失变短及PB2 蛋白第627 位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸也可使病毒的毒力变强［3］。禽流感病毒的多数强毒株感染鸡或火鸡可出现病毒血症，导致胰腺炎、心肌炎、肌炎及脑炎等。在发病后3～7 d 可检出中和抗体，在第2 周达到高峰，可持续18 个月以上。大量病毒可通过粪便排出，在环境中长期存活，尤其是在低温水中。病毒通过野禽传播，尤其是野鸭。尚不清楚病毒如何在野禽群体中长年存在，有可能以低的水平维持，即使在迁徙及越冬时也是如此。加拿大20%野鸭在向南迁飞前已轻度感染病毒，中国多种野鸭也有较高的病毒检出率［4］。

禽流感病毒可感染不同品种和日龄的禽类，且冬、春季节多发，四季可发。其中H5 和H7 亚型禽流感病毒引起高致病性禽流感被世界卫生组织（OIE）确定为A 类烈性传染病，中国也将其列为一类疫病［5］。其主要特征为突然发病，传播速度快，病死率高达100%，且禽流感病毒能感染人，某些毒株甚至可不经过混合重配再传染的过程直接感染人并致死。为了掌握贵州省正安县各种饲养模式下禽流感免疫情况，2020—2022 年对鸡进行抗体监测，以期为进一步提高正安县鸡疫病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 鸡血清来源

正安县鸡养殖主要为生态养殖，养殖形式为零星散养户、养殖场、合作社等形式。2020—2022 年科技特派员下乡时随机抽取各种养殖模式的鸡只血液制备血清进行H5、H7、H9免疫抗体检测（表1）。

表1 鸡血清样本来源

1.2 主要试剂与仪器

一次性96 孔V 型微量反应板、禽流感H5 亚型血凝抑制试验抗原、禽流感H7 亚型血凝抑制试验抗原、禽流感H9 亚型血凝抑制试验抗原、阳性血清、阴性血清均购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司。单道及多道微量移液枪、移液枪吸头、加样槽、吸管、烧杯、振荡器、恒温箱、1%鸡红细胞悬液等由正安县动物疫病控制中心兽医实验室提供。

1.3 检测方法

根据国家《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T 18936—2020）采用血凝抑制试验（HI）对所采集的660 份鸡血清进行禽流感病毒H5、H7 亚型抗体效价检测，并采用同样方法对禽流感病毒H9 亚型进行抗体效价检测。采集SPF 公鸡血液制备1%红细胞悬液。

1.3.1 血凝（HA）试验 按照倍比稀释法在96 孔微量反应板的每孔中加入25 μL PBS液，在第1 孔加25 μL 抗原，反复抽打5次混匀后由第1 孔吸取25 μL 抗原加入第2 孔，混匀后吸取25 μL 加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11 孔，从第11 孔吸取25 μL 弃去，每孔均加入25 μL 1%鸡红细胞悬液与25 μL PBS 液，将反应板置于振荡器振荡2 min，于25 ℃恒温箱中静置30 min，在对照孔红细胞呈明显纽扣状沉于孔底时观察结果。

1.3.2 血凝抑制（HI）试验 根据HA 试验测定的效价，配制4 单位（4HAU）抗原。在96 孔微量反应板的第1 孔至第11 孔加入25 mL PBS，第12 孔加入50 μL 的PBS。第1 孔加入25 μL 血清，充分混匀后吸25 μL 于第2 孔，依次对倍稀释至第10 孔，从第10孔中吸取25 μL 弃去。第1 孔至第11 孔均加入25 μL 的4HAU 抗原，于25 ℃恒温箱中静置30 min，每孔加入25 μL 1%鸡红细胞悬液，振荡混匀，再于25 ℃恒温箱中静置30 min，在对照孔红细胞呈明显纽扣状时判定结果。

1.4 结果判定

禽流感H5、H7、H9 亚型以完全抑制4HAU 抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI 效价。在阳性对照血清的HI 效价与已知效价误差不超过1 个滴度，阴性对照血清效价不高于2log2 时，试验成立。被检血清HI 效价≤3log2 判为阴性；等于4log2 判为可疑；≥5log2 判为阳性。

2 结果与分析

经血凝-血凝抑制试验检测，2020—2022 年随机抽检的660 份血清H5、H7、H9 亚型禽流感总体抗体效价阳性率分别为78.90%、77.88%、79.69%，均达到国家规定≥70%的要求；2020—2022 年正安县禽流感H5 亚型抗体阳性率分别为81.00%、79.20%、76.30%，H7 亚型抗体阳性率分别为74.00%、77.90%、82.00%，H9 亚型抗体阳性率分别为78.64%、70.00%、84.00%，H5 亚型抗体水平呈逐年下降的趋势，H7 亚型抗体水平呈逐年升高的趋势，H9 亚型抗体水平呈先降低后升高的趋势，均达到国家规定≥70%的要求（表2）。

表2 2020—2022 年正安县随机抽检血清禽流感抗体监测结果

3 小结与讨论

血凝抑制试验检测禽流感抗体是广泛应用的一种方法，具有操作简便、检测量大、敏感性好等优点［6］。试验通过对贵州省正安县禽流感病毒抗体检测发现，该地区禽流感病毒抗体检测合格率符合国家标准，得益于贵州省正安县积极的防疫检疫工作。马卫红等［5］检测发现，2017 年惠水县高致病性禽流感H5 亚型免疫抗体合格率为70.93%，H7 亚型免疫抗体合格率仅为29.33%，H7 免疫合格率较低。王兵等［6］2018 年对贵州省部分地区高致病性禽流感H5 和H7 亚型免疫抗体检测发现，被检测地区H5 亚型免疫抗体合格率为68.1%，H7 亚型免疫抗体合格率为65.75%，都没有达到农业农村部的要求，与本试验的贵州省正安县禽流感免疫抗体检测结果存在差异。比较发现，贵州省正安县高致病性禽流感H5、H7、H9 亚型免疫抗体的合格率较高，H5、H7、H9 亚型禽流感总体抗体效价阳性率分别为78.90%、77.88%、79.69%，建议贵州省正安县在维持免疫水平的基础上，建立严格的卫生管理制度。禁止鸡和水禽混养，养鸡场与水禽饲养场应间隔3 km以上，且不得共用同一水源［7］。养禽场要有防止禽鸟（包括水禽）进人饲养区的设施，防止一切带毒动物特别是鸟类以及被污染物品接触本地鸡群，并有健全的灭鼠设施和措施。同时防止人员、来访客、饲养用具等杂物的间接传播，对外来欲接触鸡的人员及车辆进行严格消毒，严格执行卫生消毒管理制度，注重饲料来源安全，不从疫区购进种蛋和鸡苗，新购进的鸡、鸡苗、孵育的小鸡必须接种疫苗，并隔离观察2 周以上［8］。

结合实际制定科学的免疫措施，并根据正安县当地疫病流行情况、饲养类型进行免疫接种，疫苗免疫接种应选择相同亚型的禽流感疫苗按免疫程序对家禽进行预防接种，研制与使用的疫苗有禽流感灭活疫苗（H5N2 亚型、H5N1 亚型、H9 亚型）、禽流感（H5N2 +H9N2）二价灭活疫苗、重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1 亚型，Re-1 株）和禽流感-新城疫重组二联活疫苗（rL-H5 株）、禽流感-鸡痘重组二联活疫苗（rFPV-H6 株）［9］。以上疫苗应按照一定的免疫程序接种，对产蛋鸡，20～30 日龄进行首免，颈部皮下注射0.3～0.5 mL，开产前20 d 进行二免，胸肌注射0.5 mL；种鸡及禽流感高发地区，在300 日龄进行三免，或在雏鸡10～12 日龄用禽流感新城疫重组二联活疫苗（rL-H5 株）滴鼻首免，以后可选择活疫苗或灭活苗免疫。对商品肉仔鸡，要根据需要确定是否接种［10］。

注意免疫监测，当抗体滴度大于5log2 时鸡群才能得到保护［11］。同时做好疫情流行的应急准备工作，一旦发生或疑似高致病性禽流感，应及时报告疫情，正确诊断，追踪调查，采取隔离、限制移动等措施，划定疫点、疫区和受威胁区，严格封锁［12］。疫区内所有禽只以不放血方式扑杀，并对所有病死禽、被扑杀禽、禽类产品、排泄物、被污染饲料、垫料、污水等按国家规定进行无害化处理，对被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行严格彻底消毒，对受威胁区内所有易感禽类采用国家批准使用的疫苗进行紧急强制免疫接种，建立完整的免疫档案［13］。发生低致病性禽流感时，可在严密隔离的条件下，进行必要的药物治疗，以减少损失［14］。配合应用清热解毒、止咳平喘的中药如板蓝根、大青叶、连翘和清瘟散等，效果更好［15］。由于该病常并发或继发大肠杆菌或支原体感染，因此适当应用抗菌药物，如氟苯尼考、强力霉素、环丙沙星、利高霉素等，以减少死亡。要有计划、有组织地收集检测信息，按照要求进行监测，建立和完善禽流感监测系统［16］。