正交设计优选苦黄温度敏感眼用凝胶提取工艺

董 琦，吕 佳

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116620)

苦黄温度敏感眼用凝胶为复方制剂，该制剂处方药物由黄芩提取物和苦参碱组成，用于治疗感染性结膜炎[1]。传统滴眼液为临床治疗眼部疾患的常用剂型，但滴眼液停留在眼中时间短，眨眼易于流失，药效维持时间不理想。为了提高产品疗效，在临床上更广泛的应用，拟用黄芩提取物和苦参碱为处方药物，制成苦黄温度敏感眼用凝胶。温度敏感凝胶在室温下呈液体状态，流动性良好。滴于眼中后在眼部温度下发生相转变，转变半固体凝胶，使药物在眼中停留时间长，不易流失，药效维持时间长。方中黄芩[2]具有清热燥湿、解毒的功效，含有黄芩苷等黄酮类活性成分，具有广谱抑菌、抗病毒、抗炎、抗变态反应等作用，其中抑菌功效显著，对包括金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌在内的眼科常见病原菌感染等均有疗效[3-4]。苦参碱为中药苦参中有效成分，对感染性结膜炎有良好的治疗作用，具有抗炎、抗病毒等生物活性[5-6]。方中黄芩用水煎煮酸沉法来制备提取物，本研究采用正交设计试验优选黄芩提取工艺条件，为苦黄温度敏感眼用凝胶[7-9]的制备工艺研究打下基础。

1 仪器与材料

1.1 仪 器

Agilent 1100型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司，Agilent Chem Station工作站；CP225D型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；CQ-250超声波清洗器，上海超声仪器厂；HH-4恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.2 药品与试剂

黄芩苷对照品(批号：16092401)，成都普菲德生物技术有限公司；黄芩饮片：经辽宁中医药大学张慧教授鉴定为正品；甲醇(色谱纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸，天津市科密欧化学试剂有限公司；蒸馏水为二次蒸馏水；其他所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品的测定方法

2.1.1 色谱条件[10]

色谱柱：WelTech月旭C18色谱柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；以甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)为流动相；流速：1 mL·min-1；检测波长为280 nm。

2.1.2 对照品溶液的制备

取黄芩苷对照品约12 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释刻度，摇匀，作为黄芩苷对照品贮备液，取黄芩苷对照品贮备液5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释刻度，摇匀，作为黄芩苷对照品溶液，浓度约为60 μg/mL。

2.1.3 供试品溶液的制备

各份提取液滤过并记录体积，取提取液1 mL，置100 mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 专属性考察

精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，测定，记录色谱图，见图1、图2。结果表明，供试品溶液上的色谱图与对照品色谱图相应的位置上有相同的色谱峰。

图1 黄芩苷对照品HPLC图

2.1.5 线性关系考察

配制系列浓度的黄芩苷对照品溶液，浓度分别为：26.2 μg/mL、39.3 μg/mL、52.4 μg/mL、65.5 μg/mL、78.6 μg/mL、91.7 μg/mL、131.0 μg/mL。精密吸取各浓度黄芩苷对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积。以对照品峰面积为纵坐标(Y)，以进样量(μg)为横坐标(X)，进行线性回归，得回归方程为：y=3 963.650 2x-14.455 8，r=0.999 96。实验结果表明，黄芩苷进样量在0.262～1.310 μg范围内线性关系良好。

2.1.6 精密度实验

精密吸取同一供试品溶液10 μL，连续进样6次，每次记录峰面积，得出黄芩苷峰面积RSD为1.14%(n=6)，结果表明该仪器精密度良好。

2.1.7 重复性实验

精密吸取同一提取液6份，按照“2.1.3”中供试品溶液制备方法处理，精密吸取10 μL进样测定。结果样品中黄芩苷含量RSD为1.26%(n=6)，结果表明，该实验方法重复性良好。

2.1.8 稳定性实验

精密吸取同一供试品溶液，分别在4、8、12、16、20、24 h进行测定，记录峰面积，计算出黄芩苷峰面积RSD值为1.13%(n=6)，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.9 加样回收率实验

取同一提取液样品共6份(黄芩苷含量10.52 mg·mL-1)，精密吸取0.5 mL，置100 mL量瓶中，精密加入黄芩苷对照品贮备溶液(1.002 mg·mL-1)5 mL，按样品含量测定项下方法操作，测定，测定结果提示：本方法对于本品回收率在96.6%～102.5%之间，平均回收率为98.1%，RSD为2.13%。结果表明该方法回收率良好。

2.2 黄芩苷提取工艺研究

2.2.1 水液煎煮法[11]提取黄芩

取黄芩饮片50 g，共9批，加水煎煮。首次加水量多加一倍水，浸泡水中1 h。

2.2.2 正交设计实验

黄芩水煎煮提取以提取时间、提取次数、加水量三个因素来考察，以黄芩苷提取量为评价指标，每个因素选用3个水平进行正交试验考察。

表1 因素水平表

表2 正交表L9(34)试验方案及实验结果

表3 方差分析表F0.05(2.2)=19.00

从试验结果的直观分析得出，影响提取效果的因素依次为提取次数，提取时间，加水量，最佳提取条件为A3B3C3。即以水为溶媒，提取3次，加水量为 9、8、8倍量，每次提取1 h。通过方差分析，溶媒量因素无显著性影响，为节省成本，可采用A1；提取时间和提取次数因素有显著性影响，提取时间可采用B3，提取次数选C3。故最终确定提取工艺参数为A1B3C3，即以水为溶媒，提取3次，溶媒为 5、4、4倍量，每次提取1 h。

2.2.3 验证实验

称取黄芩400 g，共计三份。按照优选的提取工艺条件进行了3批实验验证。按最佳工艺提取，按“2.1”下色谱条件进行测定，计算验证实验黄芩提取液黄芩苷提取量并计算转移率。结果见表4。

表4 验证实验结果

跟据三次验证试验结果，平均转移率为89.9%，平均黄芩苷提取量按药材折算与正交试验最高结果相近，证明正交设计结果良好，提取黄芩苷含量较高，可选为最佳提取工艺。

3 结 论

(1)苦黄温敏凝胶提取工艺主要采用正交设计，优选出黄芩最佳提取工艺条件[12]，为后续苦黄温敏眼用凝胶的制备和探索优化黄芩苷提取工艺的研究打下良好的基础，具有实用意义和临床应用价值。

(2)本实验以黄芩苷提取总量作为考察指标，以高效液相色谱法测定黄芩苷含量，测定方法简便可靠，准确度高。