HPLC法测定银黄甘颗粒中黄芩有效成分黄芩苷的含量*
2023-11-03郑雪媚蒋顺进黄钦耿刘宗新
郑雪媚，蒋顺进，黄钦耿，刘宗新
(1 广东容大生物股份有限公司，广东 清远 511500；2 清远一生自然生物研究院有限公司，广东 清远 511500)
猪感冒是一种急性呼吸道器官的疾病，一年四季各种类型的猪都可发生，多发于气候多变的早春和深秋，仔猪、小猪更容易发生。猪感冒等呼吸道疾病对现代养猪业的发展有较大影响。目前，猪感冒尚无特效药物，临床上主要采用抗菌药物。抗生素的长期使用和滥用，易致使病原微生物发生变异，产生耐药性，给后期疾病的防控带来困难，导致一些疾病药物无法治愈，甚至产生“超级细菌”。银黄甘颗粒由金银花提取物、黄芩提取物和甘草浸膏组方而成。方中金银花为君药，能疏散风热、清热解毒；黄芩为臣药，能增强金银花清热解毒之功效；甘草为佐使药，能助金银花、黄芩清热解毒，又能祛痰止咳。黄芩过于苦寒，苦寒伤胃，而甘草具有甘缓护胃功效。三药合用，共奏清热、解毒、止咳之功效，主治猪外感发热、咳嗽。现代药理研究表明，黄芩含有黄芩苷、黄芩素等主要活性成分，具有解热抗炎[1-3]、抗菌[4-11]、抗病毒[12-16]、抗支原体[17]、清除自由基、抗氧化[18]等药理作用。
按照中国兽药典要求[19]，根据黄芩苷的结构特点，建立测定银黄甘颗粒中黄芩苷含量的HPLC法。该方法具有定量检测准确度高、线性范围广、重现性好、分析时间短、样品处理简单等特点，为银黄甘颗粒的质量控制提供可靠的依据。
1 实 验
1.1 仪器和材料
SPD-20A日本岛津液相色谱仪、CTO-20AC柱温箱、UPR-5T超纯水仪、KQ-500DE超声波清洗器、METTLER MS105DU天平、黄芩苷标准品(含量98.8%)，中国食品药品检定研究院；银黄甘颗粒(水分为1.8%)，广东容大生物股份有限公司生产；水为超纯水；甲醇为色谱纯；磷酸为AR级别。
1.2 色谱条件
流动相：甲醇-水-磷酸(50∶50∶0.2)为流动相；
色谱柱：菲罗门C185 μm，4.6 mm×250 mm；
检测波长：274 nm；
流速：1.0 mL/min；
柱温：35 ℃；
进样量：10 μL。
1.3 溶液的配制
1.3.1 对照品溶液的制备
精密称取黄芩苷对照品20 mg，置100 mL棕色容量瓶，加甲醇溶解，取上述溶液5 mL，置25 mL棕色容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，即得。
1.3.2 供试品溶液的制备
取银黄甘颗粒适量，研细，取约0.4 g，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇40 mL，超声处理30 min，放置至室温，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取上述溶液5 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，即得。
1.4 阴性干扰测定
以相同的处方比例，按照银黄甘颗粒的制备工艺，制得黄芩提取物的阴性制剂。取黄芩提取物的阴性颗粒适量，按1.3.2项下制成黄芩提取物阴性颗粒溶液。进样测试，结果阴性溶液无干扰。证明本方法用于黄芩苷的含量测定具有专属性。
图1 黄芩苷对照品
图2 银黄甘颗粒缺黄芩样品
图3 银黄甘颗粒含黄芩样品
1.5 标准曲线的制备
精密称取黄芩苷对照品50.9 mg，置100 mL棕色容量瓶中，加甲醇使溶解，作为对照品贮备液；分别移取对照品贮备液2、5、10、15、20、25 mL置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液。对以上6种对照品溶液进样测定，记录峰面积。记录色谱图，测定结果见表1。
以黄芩苷浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见图4。结果表明，在20.12 ～251.45 μg/mL范围内，黄芩苷浓度与峰面积呈良好的线性关系，其回归方程为y=35 819x-111 380，R2=1。
1.6 精密度试验
精密称取黄芩苷对照品24.7 mg，按1.3.1项下制成每1 mL含48.8 μg黄芩苷对照品溶液。连续进样6次，记录色谱图。结果见表2。
表2 黄芩苷精密度试验
结果表明，黄芩苷峰面积RSD为0.1%，证明本方法的精密度良好。
1.7 重复性试验
对照品溶液的制备：精密称定黄芩苷对照品26.2 mg，按1.3.1项下制成每1 mL含51.8 μg黄芩苷对照品溶液。
供试品溶液的制备：取银黄甘颗粒适量，研细，按1.3.2项下制备供试品溶液，平行处理6份，进样测定。结果见表3。
表3 黄芩苷含量测定重复性试验
结果表明，黄芩苷含量RSD为0.8%，证明本测试方法重复性良好。
1.8 回收率试验
对照品母液的制备：精密称取黄芩苷对照品50.1 mg，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度使溶解，作为黄芩苷对照品母液。
对照品溶液的制备：取对照品母液5 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，即得。
供试品溶液的制备：取银黄甘颗粒研细，取约0.2 g，精密称定，共计6份，分别置50 mL容量瓶中，加甲醇40 mL，再精密加入黄芩苷对照品母液5 mL，超声处理30 min，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取上述溶液5 mL置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。进样测定，记录色谱图，结果见表4。
表4 黄芩苷含量测定回收率试验
结果显示，黄芩苷回收率的平均值为100.4%，RSD值为0.8%，表明本方法回收率较好。
1.9 黄芩苷测定方法的耐用性研究
本试验考察色谱柱温度、流速、波长、不同品牌色谱柱及流动相比例对银黄甘颗粒中黄芩苷含量测定的影响。
1.9.1 不同的色谱柱温度
对照品溶液的制备：精密称定黄芩苷对照品25.2 mg，按1.3.1项下制成每1 mL含49.8 μg黄芩苷对照品溶液。
供试品溶液的制备：取银黄甘颗粒，按1.3.2项下制备银黄甘颗粒供试品溶液。
在其它色谱条件不变的情况下，色谱柱温度分别设定为25、30、35 ℃，对同一样品进行含量测定，记录峰面积，计算黄芩苷含量，结果见表5。
表5 不同色谱柱温度对黄芩苷含量的影响
结果表明，色谱柱温度的微小变化对黄芩苷含量无明显影响。
1.9.2 不同的流速
对照品溶液的制备：精密称定银黄苷对照品25.1 mg，按1.3.1项下制成每1 mL含49.6 μg黄芩苷对照品溶液。
供试品溶液的制备：取银黄甘颗粒，按1.3.2项下制备银黄甘颗粒供试品溶液。
在其它色谱条件不变的情况下，流动相流速分别设定为0.8、1.0、1.2 mL/min，对同一样品进行含量测定，记录峰面积，计算黄芩苷含量，结果见表6。
表6 不同流动相速度对黄芩苷含量的影响
结果表明，流动相速度的微小变化对黄芩苷含量无明显影响。
1.9.3 不同的色谱柱
对照品溶液的制备：精密称定黄芩苷对照品24.7 mg，按1.3.1项下制成每1 mL含48.8 μg黄芩苷对照品溶液。
供试品溶液的制备：取银黄甘颗粒，按1.3.2项下制备银黄甘颗粒供试品溶液。
在其它色谱条件不变的情况下，使用不同的色谱柱，对同一样品进行含量测定，记录峰面积，计算黄芩苷含量，结果见表7。
结果证实，不同品牌色谱柱对黄芩苷的含量测定无明显影响。
1.9.4 不同的测定波长
对照品溶液的制备：精密称定黄芩苷对照品25.0 mg，按1.3.1项下制成每1 mL含49.4 μg黄芩苷对照品溶液。
供试品溶液的制备：取银黄甘颗粒，按1.3.2项下制备银黄甘颗粒供试品溶液。
在其它色谱条件不变的情况下，测定波长分别设定为271、272、273、274、275、276、277 nm，对同一样品进行含量测定，记录峰面积，计算黄芩苷含量，结果见表8。
结果表明，测定波长的微小变化对黄芩苷含量无明显影响。
1.9.5 不同的流动相比例
对照品溶液的制备：精密称定黄芩苷对照品25.3 mg，按1.3.1项下制成每1 mL含50.0 μg黄芩苷对照品溶液。
供试品溶液的制备：取银黄甘颗粒，按1.3.2项下制备银黄甘颗粒供试品溶液。
在其他色谱条件不变的情况下，流动相甲醇-水-磷酸比例分别设定为45∶55∶0.2、50∶50∶0.2、55∶45∶0.2，对同一样品进行含量测定，记录峰面积，计算黄芩苷含量，结果见表9。
表9 不同色谱流动相比例对黄芩苷含量的影响
结果表明，流动相比例的微小变化对黄芩苷含量无明显影响。
采用本方法能准确测定银黄甘颗粒中的黄芩苷的含量，方法的耐用性较好。
2 结 论
本实验建立了HPLC法测银黄甘颗粒中黄芩有效成分黄芩苷的含量。测定色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇-水-磷酸(50∶50∶0.2)；检测波长为274 nm。该方法定量检测准确度高、线性范围广、重现性好、分析时间短、样品处理简单，为银黄甘颗粒质量控制提供了依据。
