软枣猕猴桃黄酮体外抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

王月婵，姚佳琦，黄 夏，李艳杰，祝儒刚，陈 罡*

（1.辽宁省林业科学研究院，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁白石砬子森林生态系统国家定位观测研究站，辽宁 丹东 118201；3.辽宁大学轻工产业学院，辽宁 沈阳 110036；4.新宾满族自治县国有林业总场，辽宁 新宾 113213）

软枣猕猴桃Actinidia arguta为猕猴桃科、猕猴桃属大型落叶藤本植物，广泛分布于中国东北、华北、西北等地区，其中吉林和辽宁东部山区软枣猕猴桃资源最为丰富，同时在朝鲜半岛、日本和俄罗斯亦有分布[1]。软枣猕猴桃果实富含多糖、黄酮、三萜类、生物碱、VC、微量元素、膳食纤维等多种活性成分，因其酸甜多汁的口感和一定的保健功效，越来越受到人们的关注。

黄酮类化合物是一类植物次生代谢产物，广泛存在于多种植物的根、茎、叶、花及果实中，不仅数量种类繁多，而且结构类型复杂多样[2]。黄酮类化合物因其独特的化学结构具有许多重要的生理、生化和药理作用，是许多中草药的有效成分，具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎症、降血糖、改善神经性疾病等功效。近年来黄酮类化合物研究进程加快，对其构效关系研究不断深入，为其在医药、食品领域的应用提供了理论依据。已有研究表明，植物黄酮类化合物具有抗氧化作用，可通过抑制自由基生成、清除自由基或抑制脂质过氧化实现此效用[3]。此外，目前α-葡萄糖苷酶抑制剂主要来源于微生物、天然产物和化学合成，阿卡波糖是一种广泛应用的合成型α-葡萄糖苷酶抑制剂，能有效降低餐后高血糖，对胰高血糖素样肽-1 水平以及胰岛素敏感性能产生积极影响[4]。然而，此类抑制剂可能导致胃肠功能问题，对患有肠道基础疾病和孕妇等特定人群存在局限性。因此，研究具有体外抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶活性的天然产物具有重要现实意义。本研究通过测定软枣猕猴桃黄酮提取物对DPPH 自由基、羟基自由基的清除作用和对α-葡萄糖苷酶抑制作用，明确其体外抗氧化和降血糖的效用，为今后软枣猕猴桃黄酮类化合物的开发与利用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为种植在辽宁省林业研究院软枣猕猴桃示范基地的‘龙成2 号’果实。待果实成熟后置于有冰袋的保温箱中，带回实验室用于软枣猕猴桃黄酮提取。

无水乙醇、无水碳酸钠，购于国药集团化学试剂有限公司；抗坏血酸、硫酸亚铁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、α-葡萄糖苷酶、磷酸盐缓冲液，购于北京酷来博科技有限公司；水杨酸，购于天津市北辰方正试剂厂；过氧化氢，购于沈阳市东兴试剂厂；对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG），购于南京都莱生物技术有限公司；阿卡波糖，购于拜耳医药保健有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；智能匀浆机（上海净信实业发展有限公司）；KQ-500DE 超声波清洗机（江苏昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；循环水式真空泵（予华仪器责任有限公司）；高速冷冻离心机（艾本德仪器有限公司）；UV-2550紫外可见分光光度计（岛津仪器有限公司）；酶标仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 软枣猕猴桃黄酮提取及纯化

采用超声辅助乙醇浸提法对软枣猕猴桃果实中的总黄酮进行提取和纯化[5]。

1.3.2 DPPH 自由基清除能力的测定

将软枣猕猴桃黄酮提取液配制成0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-15 个梯度，以抗坏血酸（VC）作为阳性对照，参照Chen 等[6]的方法测定DPPH 自由基清除能力，按照公式（1）计算DPPH 自由基清除率。

式中：A1为样品组的吸光度值；A2为对照组的吸光度值；A0为空白组的吸光度值。

1.3.3 羟基自由基清除能力的测定

将软枣猕猴桃黄酮提取液分别配制5 个梯度0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1，以抗坏血酸（VC）作为阳性对照，采用Winterbourn 等[7]的方法测定羟基自由基的清除能力。羟基自由基清除计算公式同式（1）。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

将软枣猕猴桃黄酮提取液用0.1 mol·L-1、pH6.8磷酸缓冲溶液（PBS），配制2 mg·mL-1、4 mg·mL-1、6 mg·mL-1、8 mg·mL-1、10 mg·mL-1的黄酮样品液，参考Zhang 等[8]的方法进行α-葡萄糖苷酶抑制活性测定。取0.1 mol·L-1、pH6.8 的磷酸盐缓冲液120 μL、0.2 U·mL-1α-葡萄糖苷酶溶液20 μL、样品液20 μL 于96 孔板中，在37 ℃恒温培养箱中反应10 min，再加入20 μL 2.5 mmol·L-1pNPG 溶液，继续在37 ℃恒温培养箱中反应20 min，加入0.2 mol·L-1的Na2CO3溶液80 μL 以终止反应。以阿卡波糖为阳性对照，使用酶标仪在波长405 nm 处测定吸光度，按照以下公式计算软枣猕猴桃黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制率。

式中：A1为样品组的吸光度值；A2为样品空白组吸光度值；A3为对照组的吸光度值；A0为空白组的吸光度值。

1.3.5 α-葡萄糖苷酶抑制动力学试验

设定α-葡萄糖苷酶浓度为0.2 U·mL-1，设置pNPG 溶液浓度分别为1.0 mmol·L-1、1.5 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1，样品溶液质量浓度分别为0 mg·mL-1、2 mg·mL-1、4 mg·mL-1，按照1.3.4 的方法测定405 nm 吸光度值，计算反应速率。为判断软枣猕猴桃黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制类型，采用Lineweaver-Burk 双倒数法绘制曲线，将pNPG 浓度的倒数（1/S）作为横坐标，反应速率的倒数（1/V）作为纵坐标，分析其抑制特性[9]。

设定pNPG 溶液浓度为2.5 mmol·L-1，设置α-葡萄糖苷酶浓度分别为0.1 U·mL-1、0.15 U·mL-1、0.2 U·mL-1、0.25 U·mL-1，样品溶液质量浓度分别为0 mg·mL-1、2 mg·mL-1、4 mg·mL-1，按照1.3.4 的方法测定405 nm 吸光度值，计算反应速率。以α-葡萄糖苷酶浓度为横坐标，反应速率为纵坐标，确定软枣猕猴桃黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制作用的可逆性。

2 结果与分析

2.1 软枣猕猴桃黄酮体外抗氧化活性

2.1.1 软枣猕猴桃黄酮对DPPH 自由基清除能力

由图1 可知，软枣猕猴桃黄酮和VC 均对DPPH 自由基具有一定的清除作用，且清除率与软枣猕猴桃黄酮和VC 的质量浓度呈正相关。当质量浓度为1.0 mg·mL-1时，软枣猕猴桃黄酮对DPPH 自由基清除率为80.5%±2.21%，VC 对DPPH 自由基清除率为91.7% ± 1.45%。在0.2～1.0 mg·mL-1质量浓度范围内，VC 和软枣猕猴桃黄酮的IC50分别为0.18 mg·mL-1和0.42mg·mL-1，说明软枣猕猴桃黄酮对DPPH 自由基的清除作用稍差于VC。当VC 质量浓度达到0.4 mg·mL-1后清除率不再明显增加；而随着软枣猕猴桃黄酮质量浓度的增加，对DPPH 自由基的清除能力逐渐接近VC。

图1 软枣猕猴桃黄酮对DPPH自由基的清除作用

2.1.2 软枣猕猴桃黄酮对羟基自由基清除能力

由图2 可知，软枣猕猴桃黄酮与VC 同样具有清除羟自由基的作用，且清除率随着质量浓度的增加而增强，也表现出明显的量-效关系。当质量浓度为1.0 mg·mL-1时，软枣猕猴桃黄酮对羟基自由基清除率为74.1% ± 2.78% ，VC 对羟基自由基清除率为93.9% ± 1.86%。在0.2～1.0 mg·mL-1范围内，VC 和软枣猕猴桃黄酮的IC50分别为0.39 mg·mL-1和0.59 mg·mL-1，与清除DPPH 自由基的能力相似，软枣猕猴桃黄酮对羟基自由基的清除作用稍差于VC。VC 对羟基自由基的清除率呈现先增加后逐渐平稳的趋势，而软枣猕猴桃黄酮对羟基自由基清除率随质量浓度增加呈现不断上升趋势。

图2 软枣猕猴桃黄酮对羟基自由基的清除作用

2.2 软枣猕猴桃黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制活性

2.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定结果

由图3 可知，以阿卡波糖作为阳性对照，软枣猕猴桃黄酮和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制率随质量浓度增加而提高，当质量浓度为10 mg·mL-1时抑制率达到最高，即黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制率为73.2%±1.69%，阿卡波糖为80.4%±1.75%。黄酮的IC50为1.87 mg·mL-1，阿卡波糖IC50为0.43 mg·mL-1，说明阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用优于软枣猕猴桃黄酮。

图3 软枣猕猴桃黄酮对α-葡萄糖苷酶活性影响

2.2.2 α-葡萄糖苷酶的抑制动力学试验

软枣猕猴桃黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制的双倒数曲线见图4。

图4 软枣猕猴桃黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制的双倒数曲线

3 种质量浓度软枣猕猴桃黄酮抑制线性方程分别为：y=5.3167x+0.5585、y=3.6178x+0.5494、y=2.7387x+0.4718，R2分别为0.997 7、0.989 3、0.994 2。在不同软枣猕猴桃黄酮质量浓度下，各曲线在纵轴上的截距基本保持不变，而斜率随黄酮质量浓度的增加而增加。这一特征表明，Km 值（米氏常数）随着抑制剂质量浓度的增加而增加，而Vmax 值（最大反应速率）保持不变，说明软枣猕猴桃黄酮占据了α-葡萄糖苷酶的活性位点，表现出竞争性抑制特性。

判定软枣猕猴桃黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制作用可逆性如图5 所示，3 种质量浓度依次增加，各质量浓度的软枣猕猴桃黄酮抑制作用直线均经过原点，且斜率逐渐减小。由此推断，软枣猕猴桃黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有可逆性特征。若为不可逆抑制类型，随着黄酮质量浓度的变化，斜率应保持恒定。因此，可以得出结论，软枣猕猴桃黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的。

图5 软枣猕猴桃黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制作用可逆性

3 结 论

本研究通过提取软枣猕猴桃果实黄酮，测定其对DPPH 自由基清除能力、羟基自由基清除能力以及α-葡萄糖苷酶抑制活性，探讨软枣猕猴桃黄酮的体外抗氧化活性及对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。结果表明，软枣猕猴桃黄酮对DPPH 自由基和羟基自由基的清除率均在70%以上，具有较好的抗氧化活性。虽然稍差于VC，但进一步增加软枣猕猴桃黄酮质量浓度，可以提高对自由基的清除率。软枣猕猴桃黄酮对α-葡萄糖苷酶IC50为1.87 mg·mL-1，在2～10 mg·mL-1，抑制活性呈现一定的质量浓度依赖性。抑制动力学试验可推断，软枣猕猴桃黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制机制为竞争性抑制，且抑制作用是可逆的，这一结论与赵坤[10]的研究结果一致。本研究结果将为软枣猕猴桃黄酮类化合物在抗氧化和降脂降糖功能的深入研究提供理论依据。