钝叶瓦松水提取物对胰岛素代谢途径突变体果蝇代谢紊乱的影响

刘牧谣，张文芊，马海妮，许勇宜，王思宏，于世超*

（1.东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.延边大学分析测试中心，吉林 延吉 133002）

糖尿病是一种葡萄糖积累于血液循环中的慢性疾病，并伴有多种并发症，其中包括心脑血管病、肾病、眼病及足坏死[1]。其发病原因与长期胰岛素的利用或分泌缺陷有关[2]。胰岛素能够增加肌肉和脂肪对葡萄糖的吸收，并促进肝糖原的产生[3]。靶器官对胰岛素的敏感性降低，机体无法完全利用血液中的葡萄糖是胰岛素抵抗的主要标志，并且胰岛素抵抗是2 型糖尿病发病原因之一[2，4]。研究表明，PI3K/Akt 信号途径与胰岛素抵抗密切相关[5]。目前西药的降糖效果最为明显但伴有一定副作用，而中药的活性成分，例如多糖类和多酚类在治疗糖尿病的同时对身体的毒害作用较小，因此在糖尿病的临床治疗中有待深入探索[6-7]。

钝叶瓦松Orostachys malacophyllus是景天科瓦松属植物，两年生肉质草本，主要产于河北、内蒙古、辽宁和黑龙江等省区。钝叶瓦松可全草入药，具有清热解毒、消肿、止血、止痢和敛疮的功效，其主要生物活性成分为草酸、黄酮类、甾醇类、酚酸类、三萜类以及强心苷等[8-9]。目前关于钝叶瓦松药用价值的研究尚不充分，对胰岛素代谢途径的影响仍不清楚。

黑腹果蝇Drosophila melanogaster作为典型的模式生物，具有繁殖快、易培养和信号途径保守等优点，适合中药的筛选。此外，果蝇可作为模型研究胰岛素信号的调控机制[10]。研究表明，胰岛素介导果蝇中大部分营养依赖性的信号传导[11]。胰岛素等生长因子激活胰岛素受体并与之结合，诱导PI3K/Akt 活化[7]。PI3K/Akt 是控制细胞生长与代谢的重要途径[12-13]。PI3K 接收来自酪氨酸激酶或G 蛋白偶联受体的信号后，促进磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），PIP3 与磷脂酰肌醇依赖激酶Ⅰ（phosohoinostide-de‐pendent kinase 1）结合，诱导Akt 至细胞膜，调节糖原合成、糖异生和葡萄糖摄取[12-13]。Akt 又称蛋白激酶B（protein kinase B），是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，而S6 激酶（S6 kinase，S6K）是Akt 的主要底物之一，因此Akt 及S6k 的突变能够导致胰岛素代谢紊乱，从而影响果蝇的生长及脂肪代谢。

本研究探究钝叶瓦松水提取物对果蝇胰岛素代谢途径的影响，以蛹壳体积、成虫大小、翅膀面积和脂肪代谢为指标，可为治疗胰岛素代谢紊乱药物的开发提供一定理论基础。

1 材料、试剂与仪器设备

1.1 试材与试剂

试材钝叶瓦松采于延吉市烟集乡，并经过延边大学药学院吕惠子教授鉴定。Hoechst、氟硼二吡咯（Boron-dipyrromethe，BODIPY）和鬼笔环肽（Phal‐loidin）购自Life Technologies 公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 试验动物

野生型果蝇w1118购自美国布鲁明顿果蝇中心，Akt和S6kl-1/Tb 突变体果蝇由许田教授馈赠。果蝇培养条件为25℃、相对湿度60%～70%。

1.3 仪器设备

果蝇培养箱（PGY-570A-3HM，宁波莱福科技有限公司）；电子分析天平（ALC-210.4，北京赛多利斯公司）；体式显微镜（SZ51，日本Olympus 公司）；正置荧光显微镜（AxioScope A1，德国Zeiss 公司）；涡旋振荡器（Vortex-Genie 2，美国Scientific Industries公司）。

2 研究方法

2.1 钝叶瓦松水提取物的制备

准确称20 g 钝叶瓦松，用200 mL 去离子水浸泡12 h，大火加热煮沸后微火熬制3 h，经纱布过滤后收集滤液。将滤渣再次加入200 mL 去离子水，以同样方式熬制3 h，合并两次滤液并加热浓缩至100 mL，得到质量浓度为0.2 g·mL-（120%）的钝叶瓦松水提取液，室温冷却后置于-40 ℃保存备用。

2.2 果蝇培养基的制备

玉米粉-酵母培养基（普通培养基）：培养基的配制参照李文佳等所用方法[14]。钝叶瓦松水提取物培养基：将普通培养基中的去离子水换成等体积的钝叶瓦松水提取液，钝叶瓦松的质量浓度为0.1 g·mL-1（10%）。

2.3 钝叶瓦松水提取物对果蝇的影响

2.3.1 对野生型果蝇生长发育有无影响

为分析钝叶瓦松水提取物是否影响野生型果蝇的生长发育，分别收集普通培养基和钝叶瓦松水提取物培养基喂食的w1118果蝇蛹和成虫，并分析蛹壳体积和成虫面积。

2.3.2 对胰岛素途径突变体果蝇蛹壳体积的影响为分析钝叶瓦松水提取物对胰岛素途径突变体果蝇生长发育的影响，收集普通培养基喂食的野生型、胰岛素途径突变体果蝇及钝叶瓦松水提取物培养基喂食的突变体果蝇的蛹壳，显微镜观察并计算体积。

2.3.3 对胰岛素途径突变体果蝇成虫面积的影响

为研究钝叶瓦松水提取物对胰岛素途径突变体果蝇个体大小的影响，收集各组羽化时间相同的雄果蝇，对体侧面积进行比较。

2.3.4 对胰岛素途径突变体果蝇翅膀面积的影响

为量化胰岛素途径对生长的影响，测量各组果蝇的翅膀面积。

2.3.5 对胰岛素途径突变体果蝇脂肪代谢的影响

为进一步分析钝叶瓦松水提取物对细胞大小和脂肪代谢水平的影响，测定各组果蝇的脂肪油滴面积、脂肪体细胞面积以及细胞核面积。

2.4 指标的测定

2.4.1 蛹壳体积的测定

收集各组蛹壳置于载玻片上，用毛刷蘸取甘油将蛹壳固定并摆放整齐。每组分别收集30 个蛹壳用于显微镜照相。使用ImageJ 软件测量蛹壳长和宽，最后带入公式4/3p（L/2）（1/2）2（L：长度，l：宽度）计算体积[15]。

2.4.2 成虫大小和翅膀面积的测定

收集羽化时间相同的雄果蝇，二氧化碳麻醉后侧放于载玻片上。各组随机收集20 只雄性果蝇翅膀，用石蜡油固定后于载玻片上摆放整齐。在显微镜下拍摄，使用ImageJ 软件测量成虫及翅膀面积。

2.4.3 脂肪体细胞、脂肪油滴和细胞核面积的测定

各组取15～20 只三龄幼虫在凉PBS 中提取脂肪体。4% 多聚甲醛固定30 min 后，用含有0.1%Tween20 的PBS（PBST）清洗脂肪体3 次，每次5 min。然后在Phalloidin（标记细胞膜）和BODIPY（标记脂滴）染料中各染色30 min，用PBST 清洗3次后，在Hoechst（标记细胞核）中染色10 min。最后用70% 甘油封片并在荧光显微镜下观察拍照。利用ImageJ 软件测量脂肪油滴、脂肪体细胞和细胞核的面积。

3 结果与分析

3.1 水提物对野生型果蝇生长发育的影响

由图1 可见，与普通培养基相比，钝叶瓦松水提取物培养基喂食果蝇的蛹壳体积和成虫大小无显著差异（图1A～F），由此可排除钝叶瓦松水提取物对野生型果蝇生长发育的影响。

图1 水提取物对野生型果蝇蛹壳体积和成虫面积的影响

3.2 水提物对胰岛素途径突变体蛹壳体积的影响

由图2 可见，与野生型果蝇w1118相比，Akt 突变体蛹壳体积减小了4.2%，而喂食10% 钝叶瓦松水提取物的Akt 突变体蛹壳体积与w1118几乎没有差别（图2A～C，G）。由于S6k突变体果蝇携带平衡子Tb，为保证试验严谨性，采用带有该平衡子的w1118/Tb 果蝇作为对照。与w1118/Tb 果蝇相比，S6k/Tb 突变体蛹壳体积减小了14.0%，喂食钝叶瓦松后，S6k/Tb 突变体蛹壳体积的减小得到明显改善（图2D～F，G）。以上结果表明，钝叶瓦松水提取物对胰岛素代谢途径紊乱引起的蛹壳体积减小有显著缓解作用。

图2 水提取物对胰岛素途径突变体果蝇蛹壳体积的影响

3.3 水提物对胰岛素途径突变体成虫面积的影响

由图3 可见，与w1118相比，仅喂食普通培养基的Akt突变体减小了13.2%，喂食10% 钝叶瓦松水提取物的Akt个体大小得到恢复（图3A～C，G）。与w1118/Tb 相比，喂食普通培养基的S6k/Tb 突变体果蝇个体减小了10.7%，喂食钝叶瓦松的S6k/Tb 与w1118/Tb 果蝇大小无明显差异（图3D～F，G）。由此可见，钝叶瓦松水提取物对Akt及S6k/Tb 突变体果蝇成虫个体减小均有明显的缓解作用。

图3 水提取物对胰岛素途径突变体果蝇成虫面积的影响

3.4 对胰岛素途径突变体果蝇翅膀面积的影响

组织器官大小能够反映果蝇的生长状态。结果表明，与w1118及w1118/Tb 果蝇相比，Akt与S6k/Tb突变体果蝇翅膀面积分别减小了10.9%和9.7%，而喂食钝叶瓦松水提取物后，翅膀面积的减少得到缓解（图4A-G）。由此可见，钝叶瓦松水提取物能够缓解胰岛素途径突变体果蝇翅膀面积的减小。

图4 水提取物对胰岛素途径突变体果蝇翅膀面积的影响

3.5 对胰岛素途径突变体果蝇脂肪代谢的影响

上述试验表明，钝叶瓦松水提取物能够改善突变体果蝇生长发育的缺陷。为进一步分析钝叶瓦松水提取物对细胞大小和脂肪代谢水平的影响，测定了各组果蝇的脂肪油滴面积、脂肪体细胞面积以及细胞核面积。如图5 所示，与w1118相比，Akt突变体的脂肪油滴面积、脂肪体细胞面积以及细胞核大小均有所降低，分别减少了35.0%、21.2% 和9.4%。类似地，与w1118/Tb 相比，S6k/Tb 的脂肪油滴面积、脂肪体细胞面积以及细胞核大小分别减少了53.1%、11.7% 和8.4%（图5）。而喂食钝叶瓦松水提取物后，各项指标都得到了显著恢复（图5 和图6）。以上结果表明，钝叶瓦松水提取物可缓解胰岛素途径突变引起的脂肪代谢水平降低。

图5 水提取物对Akt突变体果蝇脂肪代谢的影响

图6 水提取物对S6k突变体果蝇脂肪代谢的影响

4 讨 论

糖尿病被列为世界三大疑难病之一，预计到2030 年全球将有3.66 亿人患病[16]。大量研究表明，中草药的多糖、黄酮、生物碱和皂苷等活性成分可以降低血糖浓度[17]。由此可见，在治疗糖尿病药物高需求的背景下，筛选中药的有效活性成分并开发药物已成为新的趋势。瓦松属植物具抗病毒、抗菌、抗癌、强心以及抗炎等作用，其中钝叶瓦松的药用功能开发较少，尚不清楚其对胰岛素代谢紊乱的影响[18]。

胰岛素代谢途径PI3K/Akt控制细胞的正常生长，S6K 位于该途径下游，能够促进蛋白质合成[19-20]。本研究以黑腹果蝇为模型，探究钝叶瓦松水提取物对胰岛素代谢紊乱的影响。与喂食普通培养基的Akt 和S6k/Tb 突变体果蝇相比，喂食钝叶瓦松水提取物的突变体果蝇蛹壳体积、成虫大小、翅膀面积和脂肪代谢均得到了明显改善，表明钝叶瓦松水提取物能够缓解胰岛素途径突变体果蝇的代谢紊乱。该结果为治疗糖尿病药物的开发提供了新思路。由于本研究采用水提取法，水提取物包含多种生物活性成分，因此，钝叶瓦松缓解胰岛素代谢紊乱的具体活性成分仍有待深入研究。