猫疱疹病毒I型核酸快速检测方法的建立及初步应用

段雪昆

（厦门宝太生物科技股份有限公司，福建 厦门 361000）

FHV-1有多种诊断方法。病毒分离培养可以应用于诊断急性FHV-1感染。然而，对于潜伏期FHV-1，它经常产生假阴性结果。由于90%以上的猫血清FHV-1抗体呈阳性，在临床上难以区分正常猫和患病的猫，故抗体检测很难用于FHV-1感染的辅助诊断。免疫层析法是目前唯一一种可快速检测FHV-1的方法，但由于其灵敏度受限，该法只能用于猫发病后机体排毒期间。聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)仍然是判断FHV-1感染的金标准，其中实时荧光定量PCR比传统PCR灵敏度更高。但该方法检测流程复杂，耗时较长，且需要大型设备及相对专业的检验实验室，对检测人员也有一定要求，不适用于伴随诊断。因此，从应用场景着手，需要开发一种灵敏度高，操作简单且能够迅速得到检测结果的FHV-1检测方法。

eRDA（enhanced Recombinase Dependent Amplification，增强型重组酶依赖扩增）是一种恒温核酸扩增技术。该方法只需要一个简单的加热器甚至在体温下（37 ℃）即可发生扩增反应。eRDA过程依赖于三个关键蛋白：重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换聚合酶。与PCR一样，eRDA扩增的灵敏度和特异性较高。因此，eRDA方法已经具有检测各种病原体的潜力，特别适用于设备不足的实验室或快速现场诊断等场景。基于eRDA原理，文章建立了一种FHV-1核酸快速检测方法，该法灵敏度高、特异性好，临床实用性强，搭配小型恒温扩增仪，可在20 min内完成检测并出具检测报告。该方法可用于宠物医院FHV-1的快速诊断，为有效预防和控制猫疱疹病毒感染提供了新的方向。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂及设备

文章中使用的含猫疱疹病毒靶基因的重组质粒由通用生物(安徽)股份有限公司合成。

猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫细小病毒及猫传染性腹膜炎（猫冠状病毒）样本核酸来源于厦门市2家宠物医院。

eRDA基础体系和荧光定量PCR反应体系为本实验室前期研究确定。

荧光定量PCR仪 (ABI QuantStudio3)

微量分光光度计 (Thermo Scientific， NanoDrop One)

1.2 引物设计及合成

下载GenBank中的FHV-1 TK基因片段进行多序列比对，利用Oligo 7.0软件设计FHV-1 qPCR引物探针。根据eRDA引物设计规则，在同样靶基因上设计了两组FHV-1 eRDA引物探针进行筛选优化。

要准确把握容错的限度，不能跨过容忍的必要界限，过度地容错就会变成纵错。如果容错免责的门槛设定太过抽象和宽松，容错机制很可能变成一个盾牌，成为某些有过错官员为自己工作过错提供免责的“挡箭牌”。我们认为重点从以下几个标准进行细化：

文章所用的引物序列如表1所示。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 文章所用引物

1.3 引物筛选

根据引物位置和扩增产物大小，按照下表组合分别测试不同引物对的反应情况，使用荧光定量PCR仪 (ABI QuantStudio3)进行测试，反应条件为40 ℃，30 min，以筛选出最优组合，详见表2。

表2 引物探针筛选组合

1.4 灵敏度及重复性测试

以上述优化后的反应条件测试不同浓度（106～100copies/μL）重组质粒的扩增情况，计算不同浓度各重复间的变异系数（cv%）。同时比较荧光定量PCR法的检测灵敏度和重复性。荧光定量PCR反应为25μL体系，反应程序为：95 ℃ 5 min；（95 ℃ 15 sec，60 ℃ 30 sec）40 cycle。

1.5 特异性测试

将猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫细小病毒及猫传染性腹膜炎（猫冠状病毒）临床样本核酸作为模板加入FHV1 eRDA反应体系，以相同反应条件进行检测。

1.6 临床样本测试

对采集到的20份临床样本进行检测，并和qPCR法的检测结果进行对比，计算得到阴阳性符合率和总符合率。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

在反应条件为40℃，30 min下，依据表2组合筛选，最终筛出最优的引物探针组合（图1），FHV-eRDAF1、 FHV-eRDAR2、FHV-eRDAP1荧光强度及荧光曲线线型优于其他组合，且重复性较佳，反应5 min，可检测到起峰。

图1 eRDA-FHV1反应体系引物筛选结果

2.2 灵敏度及重复性测试

2.2.1 灵敏度

以优化后的反应条件测试不同浓度（106～100 copies/μL）重组质粒的扩增情况，实验结果如图2a所示，文章建立的eRDA反应体系最低检测限为10copies/反应。相对比荧光定量PCR来说(图2b），eRDA检测法具有同等的检测水平，但时间较PCR大大缩短。配合恒温荧光扩增仪使用，还可大大降低大型qPCR设备的成本。

图2 eRDA-FHV1反应体系灵敏度测试结果

2.2.2 重复性测试

以建立的eRDA反应体系测试不同浓度各重复间的效能情况，计算不同浓度各重复间的变异系数。表3结果表明，eRDA反应体系在相同浓度的重组质粒模板测试结果（n=10），cv值均小于5%，重复性良好。荧光定量荧光定量PCR法重复性cv值也均小于5%，且重复性良好。

表3 eRDA-FHV1反应体系重复性测试结果

2.3 特异性测试

将猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫细小病毒及猫传染性腹膜炎（猫冠状病毒）临床样本核酸作为模板加入FHV eRDA反应体系，以相同反应条件进行检测。结果表明（图3），只有FHV模板有荧光扩增曲线，其他病原体核酸及空白水对照均未无荧光扩增曲线。表明文章建立的eRDA检测方法可对FHV进行特异性检测，而对猫杯状病毒、猫细小病毒及猫传染性腹膜炎（猫冠状病毒）均无交叉反应，特异性较佳。

图3 eRDA-FHV1反应体系特异性测试结果

2.4 临床样本测试

对采集到的20份临床样本进行检测，并和qPCR法的检测结果进行对比。表4结果显示，荧光定量PCR方法可检验出8份阳性样本，12份阴性样本。而文章建立的方法也检测出8份阳性样本，12份阴性样本。阳性符合率、阴性符合率及总体符合率均为100%，效能较佳。

表4 临床样本测试结果

3 结语

猫疱疹病毒在结构和致病性上与人类单纯疱疹病毒相似，都属于疱疹病毒科和α疱疹病毒亚科，其特征是在初次感染后出现潜伏期。这一因素在临床上很重要，因为即使没有重复接触病毒，疾病可能会在以后的生活中复发。猫疱疹病毒感染又称猫病毒性鼻气管炎(FVR)，是一种由猫疱疹病毒1型(FHV-1)引起的传染病，结膜炎和角膜溃疡是猫疱疹病毒1型复发及其常见的形式。

Exo荧光探针通常由一个寡核苷酸主链组成，其中包含一个碱性核苷酸类似物（THF，四氢呋喃残基），两侧分别有一个FAM基团和BHQ1猝灭基团。此外，探针3’修饰一个Block可阻止聚合酶的延伸。初始状态下荧光基团产生的荧光信号会被猝灭基团猝灭。当探针结合到相应模板上时，核酸外切酶III（exo酶）将切割探针THF位置，分离荧光基团和猝灭基团从而产生荧光信号。因此，检测Exo荧光探针信号可用于判断核酸扩增情况。

文章建立了猫疱疹病毒I型(FHV-1)核酸快速恒温扩增检测法。结果显示，该方法特异性强，能准确检测 FHV-1核酸，与猫杯状病毒、猫细小病毒及猫传染性腹膜炎（猫冠状病毒）病毒核酸无交叉反应；灵敏度高，最低可检测10 copies/反应；检测速度快，可在30 min内完成反应，对于病毒载量较高的样本，2～5 min即可得出结果；重复性好，各重复间cv%小于5%。后期可在文章基础上开发冻干型eRDAFHV1反应试剂，简化操作步骤且延长试剂保存期限，尤其适合宠物医院的现场快速检测。