红甜菜和糖甜菜块根中萜类代谢物的比较分析

赵雯雯,刘乃新,梁文召,韩广源

(1.黑龙江大学现代农业与生态环境学院,哈尔滨 150080;2.哈尔滨海关技术中心, 哈尔滨 150023)

0 引言

甜菜体内含有丰富的营养成分,包含钾、镁、铁等微量元素,以及甜菜果胶、皂苷、甜菜碱、黄酮、萜类[1]等物质。同时,甜菜具有很好的药用价值,具有抑菌、抗炎症[2]、抗肿瘤[3]、抗心律失常、抗人类致病原体和植物致病原体,缓解疲劳、抑制脂质氧化、清除氧自由基等[4]生物学功能。

萜类也称萜烯,是一类由2个以上异戊二烯单位构成,头尾连接或尾尾连接的化合物,是植物次生代谢产物的重要组成部分。萜类种类丰富,是天然产物的最大家族,属于不含脂肪酸的不可皂化脂,很多具有重要生理活性。到目前为止已经发现了95 000多种结构不同的萜类化合物。萜类具备抗炎[5]、抗菌[6]、防治关节炎[7]、增强抗氧化能力[8]、治疗胰岛素抵抗和2型糖尿病[9]、抗肿瘤[10]、体外和体内抗锥虫[11]等特性。此外,对于植物来说,萜类化合物常常在植物中作为防御机制,保护植物免受紫外线辐射、寄生虫、真菌、细菌和病毒等有害因素的侵害,能响应多种生物胁迫和非生物胁迫,萜类物质不仅可以作为防御物质,还可以协同有益微生物促进植物的生长与发育。因此无论从甜菜根中萜类成分的生物活性价值还是从甜菜抗逆性方面,研究甜菜根中萜类成分都具有一定的实际意义。

目前,红甜菜和糖甜菜根中的萜类成分的比较研究在我国尚未有报道。本研究采用超高效液相色谱-质谱联用(ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)技术,结合代谢组学分析方法[12],以红甜菜和糖甜菜根为研究材料,分析萜类化合物的种类和含量差异。为进一步开发具有萜类活性成分的甜菜种质资源,培育甜菜新种质提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取红甜菜(B.vulgarisvar.crucenta)和糖甜菜(B.vulgarisvar.Saccharifera)2种栽培型甜菜为试验材料。红甜菜品系‘一品红’由哈尔滨工业大学食品科学与工程学院程大友教授提供;糖甜菜品系‘HD802’由黑龙江大学现代农业与生态环境学院吴则东研究员提供。

1.2 试剂与仪器

试剂:甲醇、乙腈、甲酸,均为色谱纯,甲醇、乙腈品牌为Merck,甲酸品牌为Aladdin。仪器:研磨仪(MM 400),德国Retsch公司;超高效液相色谱(1290 UHPLC),品牌Agilent;串联色谱(Applied Biosystems 6500 QTRAP),美国AB Sciex公司;色谱柱(SB-C181.8 μm,2.1 mm×100 mm),品牌Agilent。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集和预处理

选取同一大田,同一生长环境下的糖甜菜(‘HD802’)和红甜菜(‘一品红’)块根作为试验材料,为减小试验误差,每个栽培种选取6株长势一致的甜菜根,处理备用。

将甜菜块根斜45°,取甜菜块根1 cm直径的圆柱体,置于冻干机进行真空冷冻干燥处理;再移至研磨仪30 Hz条件下研磨1.5 min,至粉末状;万分之一天平称取50 mg冻干粉末,将其溶解于1.2 mL 70% 甲醇提取液中,每间隔30 min的时间涡旋1次,1次漩涡时间为30 s,共进行6次涡旋;然后将样品放置于离心机中,转速12 000 rpm离心3 min,取上清液,0.22 μm微孔滤膜过滤上清液,保存于进样瓶中,用于UPLCMS/MS分析。

1.3.2 色谱条件

色谱柱:Agilent SB-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流速0.35 mL/min;柱温40 ℃;进样量2 μL。流动相:A相为超纯水(加入0.1%的甲酸),B相为乙腈(加入0.1%的甲酸),梯度洗脱见表3。

表1 梯度洗脱Table 1 Gradient elution

1.3.3 质谱条件

电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI)温度500 ℃,离子喷雾电压(IS)5500 V(正离子模式)/-4500V(负离子模式),离子源气体I(GSI)、气体II(GSII)和气帘气(CUR)分别设置为50、60和25 psi,碰撞诱导电离参数设置为高。QQQ扫描使用MRM模式,并将气体(氮气)设置为中等。通过进一步去簇电压(declustering potential,DP)和碰撞能(collision energy,CE)优化,完成了各个MRM离子对的DP和CE。根据每个时期内洗脱的代谢物,监测一组特定的MRM离子对,以获得检测峰图。

1.3.4 萜类化合物分析

利用软件Analyst进行数据采集,基于MWDB(metware database)数据库,根据混样质控样本(quality control,QC)的总离子流图及MRM代谢物检测多峰图,对样品的代谢物进行质谱定性分析。利用三重四极杆质谱的多反应监测模式完成萜类物质定量分析,分析方法为:计算一级质谱中的提取离子色谱峰的峰面积,对所有物质质谱峰进行峰面积积分,并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正,比较分析甜菜块根萜类化合物的含量。

1.4 数据分析

使用Microsoft Office Excel 2016和SPSS 23.0(IBM Corporation,Armonk,NY,USA)及正交偏最小二乘法判别分析法(Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis,OPLS-DA)进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 样本质控

样品经HPLC-MS分析,鉴定出的萜类化合物的保留时间、m/z、MS/MS 碎片离子等信息。结果显示代谢物检测总离子流的曲线重叠性高,即保留时间和峰强度均一致,表明质谱对同一样品不同时间检测时,信号稳定性较好。仪器的高稳定性为数据的重复性和可靠性提供了重要的保障。从总离子流图中可看出峰的纯度高,达到试验数据后期的分析要求。正/负离子模式下的总离子流图见图1、图2。

图1 混样样品质谱分析总离子(正离子)流图Fig.1 Totalion flow pattern analysis by mixed essence spectrum (positive)

图2 混样样品质谱分析总离子(负离子)流图Fig.2 Totalion flow pattern analysis by mixed essence spectrum (negative)

2.2 正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)

OPLS-DA分析结果显示,2组甜菜样本处于95%置信区间内,分别处于置信区间的左侧和右侧。红甜菜的样本点间距离更接近,整组的聚集程度要略强于糖甜菜样本。本次分析共得到2个主成分。糖甜菜、红甜菜分析结果:R2X=0.411,R2Y=0.972,Q2=0.828(图3),Q2值处于0.5～1,说明OPLS-DA模型的预测好,不存在过拟合现象。由OPLS-DA得分可看出2种样品代谢存在明显种间代谢差异。

图3 糖甜菜(One-CK)与红甜菜(Two-CK)对比的OPLS-DA模型分散点图Fig.3 OPLS-DA model scatter point diagram for comparison of sugar beet (One-CK) and red beet (Two-CK)

2.3 红甜菜和糖甜菜块根中萜类物质分析

红甜菜和糖甜菜中共检测出萜类物质48种,分成6种类型(见表2)。13种倍半萜,种类占2种甜菜块根中萜类物质种类的27.08%;7种单萜,种类占2种甜菜块根中萜类物质种类的14.58%;13种二萜,种类占2种甜菜块根中萜类物质种类的27.08%;7种三萜,种类占2种甜菜块根中萜类物质种类的14.58%;7种三萜皂苷,种类占2种甜菜块根中萜类物质种类的14.58%;1种名为布卢门醇C的其他萜类物质。

表2 红甜菜和糖甜菜块根中萜类物质相对含量分析Table 2 Analysis on the relative contents of terpenoids in roots of red beet and sugar beet

2.4 红甜菜和糖甜菜块根中萜类物质差异分析

比较红甜菜和糖甜菜块根中萜类物质的相对含量,结果表明:红甜菜和糖甜菜差异代谢物共有6种。红甜菜块根中高于糖甜菜块根的萜类成分有4种,包括去氢木香内酯,30-去甲常春藤皂苷元、地肤子皂苷Ic和齐墩果酸-3-O-木糖基(1→3)葡萄糖醛酸苷。糖甜菜块根的萜类成分中高于红甜菜块根有2种,分别是女贞苦苷和异鸡蛋花素(见表3),其他没有显著性差异的萜类代谢物有42种(见图4)。

图4 2组样本差异代谢物比对火山图Fig.4 Comparison of differential metabolites between two sample groups using a volcano plot

表3 红甜菜和糖甜菜块根中萜类差异代谢物Table 3 Differential metabolites of terpenoids in roots of red beet and sugar beet

3 讨论

红甜菜主要作为一种蔬菜,在我国南方地区较为盛行。而糖甜菜主要作为制糖原料广泛种植在我国的东北、西北和华北地区。从2种甜菜中共检测出48个萜类物质,在这48个萜类成分中去氢木香内酯、女贞苦苷、齐墩果酸、地肤子皂苷等萜类成分具有一定的生物活性和药用价值。

去氢木香内酯是一种天然倍半萜化合物,具有抗氧化、抗炎[13-14]、抗菌[15]、抑制慢性髓系白血病[16]以及抑制喉癌[17]、胶质瘤[18]等多种肿瘤细胞的增殖活性,诱导肿瘤细胞凋亡等功能。本研究结果表明,红甜菜根中去氢木香内酯的含量约是糖甜菜中含量的9.72倍。此外,去氢木香内脂和木香烃内酯作为木香主要的有效成分,具备调节消化系统作用[19],改善胃肠道功能[20]等生物活性。

女贞苦苷是一种环烯醚萜类物质。环烯醚萜类作为许多中药的天然有效的生物活性成分,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗原虫、保护活性神经、免疫调节、降血糖及保肝活性[21]。本研究中,糖甜菜块根中女贞苦苷的含量是红甜菜块根中含量的2.28倍。

齐墩果酸存在于多种植物,具有抗病毒、防骨质疏松、治疗银屑病、修复溃疡皮肤疤痕等功能[22],还能够抗高血糖[23],改善脂肪肝病[24],延缓细胞衰老[25],促进骨折愈合[26],治疗银屑病[27],抗癫痫[28],增强果实抗病性[29]。本研究表明红甜菜块根中齐墩果酸的含量为糖甜菜块根中含量的6.62倍。

地肤子皂苷是一种天然三萜皂苷,能够抗前列腺癌[30],保护胃损伤[31]。还可作为祛湿止痒颗粒抗瘙痒、抗炎、抗过敏的主要有效成分[32-35]。天然植物地肤子乙醇提取物对羟基,DPPH和ABTS+自由基均有一定的清除能力[36]。本研究结果表明,红甜菜块根中地肤子皂苷的含量约是糖甜菜中含量的3.73倍。

此外,已有研究表明萜类物质可以在植物感染病原菌后被诱导并释放出来,达到提高植物抗逆性的作用。在本研究中,从甜菜根中检测出的48个萜类物质是否对甜菜根抗病性有影响尚未有报道,因此可以作为新的研究课题进行深入研究。

4 结论

红甜菜和糖甜菜共鉴定得到6类48种萜类代谢物。包括13种倍半萜,7种单萜,13种二萜,7种三萜,7种三萜皂苷以及布卢门醇C。红甜菜和糖甜菜中的萜类差异代谢物有6种,红甜菜块根中相对含量高的成分是去氢木香内酯、30-去甲常春藤皂苷元、地肤子皂苷Ic和齐墩果酸-3-O-木糖基(1→3)葡萄糖醛酸苷,糖甜菜块根中相对含量较高的成分是女贞苦苷和异鸡蛋花素。明确不同甜菜根中萜类代谢物的差异,可以为新药物研发以及培育具有特殊活性成分的新甜菜品种提供研究基础,萜类成分的植物防御功能有待进一步研究。