美国引进甘蔗热带种的ARMS PCR真实性鉴定

李旭娟,毛 钧,赵培方,刘洪博,王晓燕,陆 鑫

(云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室,云南开远 661699)

0 引言

甘蔗(Saccharumspp. Complex)是一种生长于热带和亚热带的草本植物,属于禾本科甘蔗属(SaccharumL.),是一种重要的糖料作物,其产糖量分别占世界食糖总产量的80%和中国食糖总产量的90%[1-3]。甘蔗也是一种重要的可再生能源植物,其乙醇产量占全球生物乙醇产量的26%[2],因此,甘蔗在食糖产业和农业经济中占有极其重要的地位[4]。甘蔗优良品种选育是保障我国蔗糖产业高质量发展的关键。目前,世界各国育成甘蔗品种血缘大多来自几个有限的原种,遗传基础同质化导致近半个多世纪以来甘蔗育种在产量、糖分和抗性方面一直难有较大突破[5]。据2014年联合国粮食及农业组织(FAO)数据显示,自1960年以来,与水稻、小麦、玉米、大豆、甜菜等作物相比,甘蔗产量和糖分改进明显滞后且增速缓慢[6]。未来的甘蔗新品种选育如何突破产量、糖分和抗性的多重瓶颈值得每个甘蔗育种工作者深思[7]。种质资源是所有农作物育种的物质基础,甘蔗育种史上每次重要突破均与优异亲本种质资源的发现和有效杂交利用有关,可见甘蔗优异种质新亲本的开发利用是突破目前甘蔗育种瓶颈最直接有效的途径[8]。

现代甘蔗栽培品种主要是由热带种(SaccharumofficinarumL., 2n = 80, x = 10)和割手密(SaccharumspontaneumL., 2n = 40～128, x = 8)杂交而来的非整倍体,且与热带种进行了多次回交[9],其染色体数目2n = 100～130,其中70%～80%的染色体来自于热带种,10%～20%来自于割手密,而染色体的5%～17%为两个种间的染色体重组类型[10-12]。可见,热带种和割手密是现有甘蔗栽培种中不可或缺的种质资源[13],尤其是热带种,在甘蔗育种中占有举足轻重的地位。热带种又被称为“高贵种”,起源于印尼东部——新几内亚[14],具有植株高大、高糖分、低纤维等优质工、农艺性状,是现代甘蔗栽培品种高糖、高产基因的最主要来源。我国被认为是甘蔗的起源中心之一,有较丰富的甘蔗野生资源[15],但无本土热带种分布。因此,从国外收集引进我国匮乏的甘蔗热带种资源并创新利用,已成为我国甘蔗科技创新驱动战略的重要组成部分。

甘蔗热带种在育种上主要作为高贵化育种的原始亲本和回交亲本,其真实性直接影响甘蔗高贵化育种效率。因此,引进热带种必须经过真实性鉴定评价,从而确保种质创新的源头亲本准确无误。传统的热带种真实性鉴定方法采用体细胞染色体计数法。甘蔗典型热带种染色体数2n=80,染色体基数x=10[11],其代表品种如‘Badila’、‘Black Cheribon’等。但同时也存在染色体数目大于80条的非典型热带种,一般认为这类非典型的热带种是热带种与割手密之间的自然杂交后代[16-17]。近年来分子标记技术也被广泛用于甘蔗种质资源的真实性鉴定,其中四引物扩增受阻突变体系PCR技术(Tetra-primer amplification refractory mutatiaon system PCR,Tetra-primer ARMS PCR)是一种针对物种的已知序列中SNP突变设计的引物,该引物扩增时由于物种间碱基的差异而引物结合竞争性不同,最终扩增得到不同条带而区分不同物种[18]。本研究利用YANG等[19]根据割手密与甘蔗属其他种质在nrDNA-ITS序列中有特异突变SNP设计的ARMS PCR引物及其体系,对国家甘蔗种质资源圃从美国引进保存的24份疑似热带种的甘蔗种质进行热带种真假鉴定,以期明确其真实性并进一步应用于甘蔗新血缘优良亲本的创制及遗传改良。

1 材料与方法

1.1 试验材料

24份供试甘蔗材料为2014年12月从美国引进,以热带种‘Badila’、割手密‘云南82-114’和杂交品种‘新台糖22’为对照材料(名单见表2)。上述所有材料均由国家甘蔗种质资源圃提供。

1.2 试验方法

1.2.1 供试材料基因组DNA提取

选取田间长势良好的甘蔗材料幼嫩叶片带回实验室,剔除叶脉并剪碎后置于无菌处理放有磁珠的2 mL圆底离心管内,液氮速冻后于新锐精仪(Gd 200)组织研磨仪打碎后用EASYPure Plant Genomic DNA Kit进行基因组DNA提取。提取后的基因组DNA稀释至50 ng/μL后于-20℃保存备用。

1.2.2 四引物ARMS PCR

以上述基因组DNA为模板,参考YANG等[19]报道的4条引物FO13、RO13、FI16和RI16(FO13:GTTTTTGAACGCAAG TTGCGCCCGAGGC;RO13:AATTCGGGCGACGAAGCCACCCGATTCT;FI16:GCCGGCGCATCGGC CCTAAGGACCTAT;RI16:GAGCGGCTATGCGCTGCGGTGCTTCT,引物委托华大基因合成),利用全式金2×Easy Taq PCR Super Mix进行PCR,PCR体系及程序参考YANG等[19]文章稍作修改,使用降落PCR,体系见表1。程序为95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,78 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,后续每个循环退火温度降低1 ℃,降至72 ℃,共6个循环;95 ℃变性30 s, 71 ℃退火10 s, 72 ℃ 延伸10 s, 最终72 ℃延伸5 min。PCR结束后取5 μL产物经2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

表1 Tetra-primer ARMS PCR 体系Table 1 Tetra-primer ARMS PCRmixtures

2 结果与分析

四引物ARMS-PCR结果表明(图1),27份所有供试材料都有一条428 bp的共有条带,除共有条带外,热带种‘Badila’(2号泳道)、割手密‘云南82-114’(3号泳道)分别扩增出有一条278 bp和203 bp的特有条带,而品种‘新台糖22’(1号泳道)同时具备上述3条条带。电泳结果显示(图1),供试材料中有‘IN 84-072’(6号泳道)、‘Black Fiji’(7号泳道)、‘Green German’(10号泳道)、‘NG 21-002’(26号泳道)和‘Chittan’(27号泳道)5份材料电泳带型与拔地拉(2号泳道)带型一致,仅出现428 bp的共有条带和278 bp的热带种特有条带,初步判定该材料为真实热带种材料,而其余19份材料带型与品种‘新台糖22’(1号泳道)一致,推测为杂种(表2)。

图1 四引物ARMS PCR 产物电泳结果Fig.1 Electrophoretogram of tetra-primer ARMS PCR products

表2 供试材料清单及热带种真假鉴定结果Table 2 List and authenticity results of the test materials

3 讨论与结论

热带种又叫“高贵种”,在甘蔗育种中占有举足轻重的地位,是现代甘蔗栽培品种高糖、高产基因的主要来源。严格意义上的高贵化是指真实(典型)热带种为母本,与作为父本的野生种杂交,后代再连续与真实热带种回交的过程,该过程中热带种通常以2n配子形式传递,该传递方式可以增加热带种血缘比例,达到快速恢复高糖、多汁、粗茎等性状[20]。可见,甘蔗高贵化育种既能保证热带种的高糖高产的高贵化基因得以保持,又能逐渐渗入野生种质的抗性基因到杂交后代,进而推进甘蔗遗传改良育种进程,但若将假热带种当作典型热带种作为母本或回交亲本,将会延缓高贵化育种进程,而且不利于品种的改良,因此,明确热带种的真实性对甘蔗育种至关重要[21]。

甘蔗热带种真实性鉴定可以通过生物学的形态标记(Morphological markers)、细胞学标记(Cytological markers),生化标记(Biochemical markers)以及目前的分子标记(Molecular markers)进行鉴定[22]。形态学鉴定是跟据育种家个人经验,易受外部环境条件,甘蔗生育期等因素的影响,具有较强的主观性,仅用于初步鉴定。细胞学标记主要是通过染色体核型(数目、大小、位置)和带型等差异进行分析的技术,但由于甘蔗是高度杂合的多倍体,染色体小且数目多等导致鉴定结果不精准。生化标记的一个重要方法是同工酶分析,而同工酶易受环境、植物栽培条件和生长阶段的影响,也只能作为一种辅助性的鉴定手段[23]。近年来,一些分子标记如SSR、RAPD、ISSR等被用于甘蔗种质鉴定,尤其是其杂交后代的鉴定[24-25]。但常规分子标记具有一定的局限性,它会产生多个扩增条带,使得解释结果复杂化。SNPs作为第三代分子标记,具有高度稳定性,也因此受到了高度关注,被广泛应用于物种亲缘关系鉴定、种质鉴定、种质资源保存与管理、基因库构建等研究领域[26]。Tetra-primer ARMS PCR技术是一种在普通PCR基础上发展起来的单核苷酸多态性(SNP)分型技术,该技术具有操作简便、分型快速、费用低廉等特点,在国内外生命科学领域尤其是遗传育种领域的应用越来越广泛[18]。现已被广泛应用于分析和鉴定水稻、小麦、甜薯等各种种质基因型[27-29]。YANG等根据割手密与甘蔗属其他种质在nrDNA-ITS序列中有特异突变的SNP,设计的ARMS PCR引物及PCR体系,已成功用于割手密及其后代材料真实性鉴定[19],其课题组还用该体系对‘50uahapele’、‘Muckche’、‘白眉蔗’和‘Canablanca’4份疑似热带种进行真实性鉴定,结果表明,这4份材料均为假热带种(数据尚未公开发表),其结果与王平[30]对这4份材料的GISH鉴定结果一致。本人前期研究中通过Tetra-primer ARMS PCR和染色体计数法对斯里兰卡引进的疑似热带种的甘蔗种质进行了真实性鉴定,二者鉴定结果一致(数据尚未发表),说明Tetra-primer ARMS PCR适用于甘蔗热带种真实性初步快速鉴定。

本研究通过四引物扩增受阻突变体系PCR鉴定结果表明:24份美国引进的疑似热带种的甘蔗种质中,有‘Green German’、‘Black Fiji’、‘Chittan’、‘IN 84-072’和‘NG 21-002’5份材料为真实热带种材料,后续应加强其农艺性状和抗性调查,并将其作为甘蔗热带种新血缘亲本进行杂交利用。