基于代谢组学技术探讨肾阳方治疗骨质疏松症肾阳虚证的作用机制

黄晨,施杞,王拥军,唐德志

(上海中医药大学附属龙华医院,上海 200032)

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种常见的代谢性骨病,其特征为骨量减少和骨组织微结构损坏,导致骨脆性增加、易于发生骨折[1-2]。随着人口老龄化问题日益严重,OP已成为我国50岁以上人群的重要健康问题[3-4]。国医大师施杞教授以肾阳方为基础方治疗OP肾阳虚证,临床疗效较为理想,但其作用机制尚不明确。代谢组学是对细胞内源性和外源性代谢产物进行定量鉴定和定性分析,以揭示生物代谢产物的代谢途径与观察到的生理和/或病理变化之间的相对关系的方法,已被广泛应用于生物标志物检测、药物疗效监测和发病机制研究[5]。本研究采用代谢组学技术探讨了肾阳方治疗OP肾阳虚证的作用机制,现总结报告如下。

1 材料与仪器

1.1 实验动物2月龄雌性SD大鼠30只,体质量(200±10)g,实验动物合格证号:SCXK(京)2019-0010。大鼠在上海中医药大学动物房饲养,自由饮水、进食。实验方案经上海中医药大学实验动物伦理委员会审查通过,伦理批件号:PZSHUTCM210625007。

1.2 药品及试剂肾阳方,药物组成包括肉苁蓉 12 g、淫羊藿9 g、骨碎补9 g,所有中药饮片均购自上海中医药大学附属龙华医院中药房。向中药饮片中加入饮片质量12倍量水,浸泡30 min,煎煮30 min后趁热过滤,滤渣再加入12倍量水,煎煮30 min后趁热过滤,合并2次滤液,浓缩至1.03 g·mL-1。氢化可的松注射液(天津金耀药业有限公司),雌二醇(estradiol,E2)ELISA测试盒、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)ELISA测试盒、环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)ELISA测试盒、Ⅰ型胶原C末端肽(C-telopeptide of type Ⅰ collagen,CTX-Ⅰ)ELISA测试盒、骨钙素(osteocalcin,OCN)ELISA测试盒(南京建成生物工程研究所),MxP®Quant 500靶向代谢组学试剂盒(Biocrates公司)。

1.3 实验仪器vivaCT80 Micro-CT(Scanco公司),紫外分光光度计(Beckman Coulter公司),QTRAP 6500+液相质谱联用仪(SCIEX公司)。

2 方 法

2.1 动物分组将30只大鼠称重后按体质量排序编号,从随机数字表中选取30个连续2位数记录在大鼠编号下方,再将30个随机数字从小到大排序,随机数字排序1～10对应的大鼠纳入对照组、11～20对应的大鼠纳入模型组、21～30对应的大鼠纳入为肾阳方组。

2.2 造模及干预禁食不禁水12 h后,采用3%戊巴比妥钠按1 mL·kg-1腹腔注射麻醉,对照组大鼠从双侧卵巢附近切除少量脂肪组织,其余2组大鼠按照文献[6]中的方法摘除双侧卵巢。造模手术1个月后,模型组和肾阳方组大鼠按照20 mg·kg-1皮下注射氢化可的松注射液(5 mg·mL-1)进行肾阳虚证造模,每天1次,连续注射14 d[7-9]。造模结束后,肾阳方组按生药5.14 g·kg-1·d-1以肾阳方药液灌胃,其余2组均以等量生理盐水灌胃,连续干预60 d。

2.3 实验指标检测

2.3.1一般情况观察 药物干预结束后,观察各组大鼠外观、精神状况及活动情况。

2.3.2血清指标检测 观察结束后腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠,先经腹主动脉取血,再脱颈处死大鼠。分离血清,取部分血清采用ELISA法检测E2、cAMP、cGMP、OCN、CTX-Ⅰ含量,具体操作按照测试盒说明书进行。

2.3.3骨密度及骨组织微结构检测 采用vivaCT80 Micro-CT对所有大鼠的L4进行三维扫描,获得重建图像后进行定量分析,获取骨密度、骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁厚度、骨小梁分离度。

2.3.4血清代谢组学分析 采用超高效液相色谱-质谱法对各组大鼠的血清进行代谢组学分析。平台为QTRAP 6500+液相质谱联用仪,试剂盒选用MxP®Quant 500靶向代谢组学试剂盒。使用SCIEX Analyst软件对代谢组学数据进行量化,并将数据导入MetIDQ软件一步处理。数据归一化、标准化处理后进行偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA),根据差异倍数绘制火山图,结合PLS-DA模型变量重要性投影≥1、差异倍数≥1.2或≤0.833、P<0.05(t检验)筛选差异代谢物,并对其进行KEGG通路富集分析。

2.4 数据统计采用SPSS25.0软件进行数据统计分析。3组大鼠E2血清含量、cAMP血清含量、cGMP血清含量、cAMP/cGMP、OCN血清含量、CTX-Ⅰ血清含量、骨密度、骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁厚度、骨小梁分离度的组间总体比较均采用单因素方差分析,组间两两比较均采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

3 结 果

3.1 一般情况观察结果与对照组相比,模型组大鼠出现脚趾和耳朵颜色变淡、泛白,体毛颜色暗淡、发黄、枯萎、粗糙,精神萎靡,活动减少,抓取抵抗性降低,喜扎堆等肾阳虚证表现;肾阳方组大鼠上述表现较模型组明显改善(图1)。

图1 3组大鼠药物干预结束后外观图

3.2 血清指标检测结果3组大鼠E2血清含量、cAMP血清含量、cAMP/cGMP、OCN血清含量、CTX-Ⅰ血清含量比较,组间差异均有统计学意义;3组大鼠cGMP血清含量的差异无统计学意义。对照组和肾阳方大鼠的E2血清含量、cAMP血清含量、cAMP/cGMP、OCN血清含量均高于模型组(P=0.000,P=0.002;P=0.001,P=0.014;P=0.000,P=0.012;P=0.004,P=0.008),CTX-Ⅰ血清含量均低于模型组(P=0.000,P=0.013)。见表1。

表1 3组大鼠血清指标检测结果

3.3 骨密度和骨组织微结构检测结果3组大鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁厚度、骨小梁分离度比较,组间差异均有统计学意义。对照组和肾阳方组的骨密度、骨体积分数、骨小梁数目均高于模型组(骨密度:P=0.000,P=0.007;骨体积分数:P=0.000,P=0.012;骨小梁数目:P=0.000,P=0.023),骨小梁分离度均低于模型组(P=0.000,P=0.006);对照组的骨小梁厚度大于模型组(P=0.006),肾阳方组和模型组骨小梁厚度的差异无统计学意义(P=0.068)。见图2、表2。

表2 3组大鼠骨密度和骨微结构检测结果

图2 3组大鼠L4 Micro-CT三维扫描图

3.4 血清代谢组学分析结果

3.4.1PLS-DA结果 对照组和模型组、肾阳方组和模型组的代谢物均能明显分离,表明OP肾阳虚证大鼠的血清代谢物轮廓发生了改变,肾阳方治疗能够改变这种代谢物的轮廓(图3)。

Con为对照组,Mod为模型组,Tre为肾阳方组;横坐标Component 1、纵坐标Component 2分别表示第一主成分、第二主成分。图3 3组大鼠血清代谢物偏最小二乘判别分析二维得分图

3.4.2差异代谢物筛选结果 模型组较对照组有21个代谢物上调、7个代谢物下调,肾阳方组较模型组有89个代谢物上调、9个代谢物下调(图4)。这些差异代谢物中13个为氨基酸或与氨基酸有关,93个为胆固醇酯、鞘磷脂、甘油二酯、甘油三酯等脂质代谢物。模型组较对照组CE(15∶0)浓度上升、TG(16∶0_37∶3)浓度下降,肾阳方组较模型组CE(15∶0)浓度下降、TG(16∶0_37∶3)浓度上升。

每个圆点代表1个代谢物,灰色表示差异无统计学意义,蓝色表示下调,红色表示上调,颜色越深表示差异越显著。图4 3组大鼠差异代谢物筛选火山图

3.4.3差异代谢物通路分析结果 KEGG通路富集分析结果显示,对照组和模型组差异代谢物的信号通路有氨酰tRNA生物合成、谷胱甘肽代谢、氨基乙酸-丝氨酸-苏氨酸代谢、苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸生物合成、泛醌和其它萜类-醌生物合成、苯丙氨酸代谢、组氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、卟啉和叶绿素代谢、二羧酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、酪氨酸代谢、初级胆汁酸生物合成,肾阳方组和模型组差异代谢物的信号通路有氨酰tRNA生物合成、生物素代谢、精氨酸生物合成、硒代谢、赖氨酸降解、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢(图5)。

图5 3组大鼠差异代谢物KEGG代谢通路富集结果图

4 讨 论

cAMP、cGMP血清含量及其比值被认为是诊断肾虚证的客观指标,大部分肾阳虚证患者cAMP/cGMP比值均会明显降低[10-11]。本研究通过去卵巢结合皮下注射氢化可的松建立OP肾阳虚证模型。大鼠一般情况、血清指标及骨密度及骨组织微结构检测结果的变化提示,本研究中OP肾阳虚证模型造模成功。

目前针对OP肾阳虚证的代谢组学研究较少,而且结果不尽相同。郭胜男等[12]筛选出的原发性OP肾阳虚证患者血清特征性代谢物共221个,包括γ-氨基丁酸、L-异亮氨酸、谷氨酸等,这些差异代谢物参与的信号通路有色氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等。朱庭辰[13]的研究发现,与原发性OP肾阳虚证有关的2个代谢标志物为L-苯丙氨酸和s-乳糖谷胱甘肽。本研究结果显示,模型组较对照组有21个代谢物上调、7个代谢物下调,肾阳方组较模型组有89个代谢物上调、9个代谢物下调。这些差异代谢物中13个为氨基酸或与氨基酸有关,93个为脂质代谢物。

本研究结果显示,氨酰tRNA生物合成通路为模型组与对照组,模型组与肾阳方组差异代谢物富集的共同代谢通路。氨基酸需要被氨酰tRNA合成酶催化,并与其对应的tRNA结合形成氨酰tRNA才能参与到蛋白质合成过程中[14]。因此,我们认为OP肾阳虚证模型大鼠体内氨基酸合成发生变化可能会影响蛋白质合成,从而对骨健康产生负面影响。谷胱甘肽代谢和精氨酸生物合成分别是对照组与模型组、肾阳方组与模型组代谢差异物富集到的差异最明显且与骨代谢有关的通路。谷胱甘肽是一种由半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸组成的小分子肽,具有抗氧化作用和整合解毒作用。谷胱甘肽有还原型和氧化型2种形式,生理条件下机体内存在的谷胱甘肽以还原型为主。研究表明,还原型谷胱甘肽可以促进高糖环境下成骨细胞的增殖、分化[15-16]。代志鹏[17]的研究表明,谷胱甘肽可以通过降低细胞内活性氧的水平抑制人骨髓间充质干细胞成脂分化,增强成骨分化。Jiang等[18]的研究表明,口服精氨酸可以促进大鼠长骨的线性生长,认为这可能与精氨酸调控神经元型一氧化氮合酶-一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)-鸟苷酸环化酶-cGMP通路,使下丘脑生长抑素基因表达下调、垂体生长激素基因表达上调、垂体生长激素分泌增多有关。张世旭等[19]的研究显示,腹腔注射左旋精氨酸能提高骨质疏松性骨折大鼠血清NO及NOS浓度,提高骨质疏松性骨折大鼠的骨痂骨密度和腰椎骨密度。镐英杰等[20]的研究表明,左旋精氨酸能上调成骨细胞中护骨素蛋白的表达,认为这可能是通过激活内皮型NOS和诱生型NOS实现的。

以往的研究发现,甘油三酯葡萄糖指数是OP的独立影响因素,可作为鉴别OP的客观指标[21];不饱和脂肪酸对防治OP有积极作用[22];富含不饱和脂肪酸的罗非鱼鱼头脂质可以通过调整肠道菌群、下调5-羟色胺表达等方式延缓OP病情进展[23];骨髓微环境中的脂肪酸可以触发多种信号通路,直接或间接对OP产生有益或者有害的影响[24]。这些研究表明,脂质代谢与骨代谢有关。

本研究的结果提示,OP肾阳虚证的发生可能与氨基酸、脂质代谢紊乱有关,肾阳方治疗可以纠正部分氨基酸、脂质代谢紊乱,从而治疗OP肾阳虚证。本研究筛选出的与OP肾阳虚证有关的生物标志物中,大量脂质分子的作用目前尚不清楚,也无法匹配信号通路,因此脂质代谢与OP肾阳虚证的关系还有待进一步研究。