中药饮片耐胆盐革兰阴性菌量化风险评估研究*

宋 琳，白秀秀，李 辉

（1. 陕西省药品和疫苗检查中心咸阳分中心，陕西咸阳 712000； 2. 西安汉丰药业有限责任公司，陕西西安710050； 3. 陕西盛德泰林生物安全技术检测有限公司，陕西西安 710077）

微生物污染是中药饮片质量安全的不确定性风险，部分饮片因无须再做进一步的煎煮处理即使用［1］，需特别关注其用药安全。2015 年版《中国药典》首次在直接口服和泡服类饮片的质量控制指标中纳入耐胆盐革兰阴性菌和沙门菌，2020 年版《中国药典》增加了需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数和大肠埃希菌指标［2］，进一步加强了对2种饮片的微生物限度要求。耐胆盐革兰阴性菌指标泛指能在规定培养条件下在结晶紫中性红胆盐培养基上生长的微生物，包括肠杆菌属、产气单胞菌属、假单胞菌属等［3］，是反映中药饮片卫生状况的重要指标，该指标兼具描述污染种类和数量的特点，是进行风险评估的理想指标。据报道，中药饮片主要污染微生物情况复杂且分布不均匀，但总体细菌污染率较高，其中耐胆盐革兰阴性菌污染问题较突出［1，4-8］。从数量上看，污染的耐胆盐革兰阴性菌平均对数值为2～3［4］，从种类上看，主要是革兰阴性菌。甘永琦等［5］结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和高通量测序技术分析了通草等9 个中药饮片耐胆盐革兰阴性菌污染情况，发现耐胆盐革兰阴性菌分布不均，主要是肠杆菌属、泛菌属及其他属微生物。本研究中利用风险评估工具量化中药饮片耐胆盐革兰阴性菌的风险，同时考虑污染种类、数量等因素，为中药饮片的微生物风险管理提供新思路。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 中药饮片数据收集

以“中药饮片”“饮片”“中药材”和“微生物”“耐胆盐革兰阴性菌”等为关键词，检索中国知网数据库2012年1 月1 日至2021 年12 月31 日发表的相关文献，最终纳入文献15 篇。筛选和整理文献数据，剔除信息不完整、表述模糊的数据，对直接以测定数值报道的数据进行对数转换。为便于统计，以N表示耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数，N＜10 cfu/ g 时行对数转换后均以0.5 计；N＞104cfu/g 且无具体测定值时以4.5 计；当未以N描述时，按N＞103cfu/g和N＞104cfu/g统计饮片所占比例；对于可计算耐胆盐革兰阴性菌平均值的，转化为平均值进行数据分析。

1.2 量化风险评估模型建立

多种风险评估工具可用于量化风险评估，根据人用药品注册技术国际协调会议（ICH）Q9风险管理的基本原则对中药饮片耐胆盐革兰阴性菌的安全风险进行识别、分析和评价，建立失效模式和效应分析模型（FMEA）识别失效模式。FMEA 主要考虑3 个方面的因素，耐胆盐革兰阴性菌的可检测性（DET）、检出频率（即发生的可能性，OCC），以及类群特征和是否为直接口服和泡服类饮片确定危害严重性（SEV），以评估风险。按以上规则形成中药饮片耐胆盐革兰阴性菌风险评估模型，详见表1。

表1 基于FMEA的中药饮片耐胆盐革兰阴性菌风险评估模型Tab.1 Risk assessment model for bile salt-resistant Gram-negative bacteria in TCM decoction pieces based on FMEA

1.3 风险等级判定标准

以风险指数（RPN）定量描述风险大小，RPN =SEV ×OCC×DET。每个因素根据程度不同分为3 个等级分别赋值。通过评估3 个因素的综合影响，按RPN 值的大小判定风险等级，1～4为低风险，6～12为中风险，18～27 为高风险。考虑中药饮片耐胆盐革兰阴性菌组成和分布的复杂性，为弥补风险评估系统的不足，需对风险指数评价系统进行修正。规定当SEV 为1 或3 时，无论RPN 为何值，均认为是低或高风险。高风险需重点关注，并考虑微生物控制措施降低风险，并监测剩余风险；中风险需进行风险收益分析，确定是否采取适当措施降低风险等级；低风险无须采取风险应对措施，为可接受状态。

2 结果与分析

确定参与量化风险评估的中药饮片品种共53 个、760 批次。中药饮片耐胆盐革兰阴性菌污染状况及量化风险评估结果见表2。其中N1及N2分别代表N＞103cfu/g菌及N＞104cfu/ g 菌；某些品种因文献数据分析结果差异大，故标以不同数字分开统计。可见，穿心莲、两头尖、部分枸杞和部分麦冬饮片耐胆盐革兰阴性菌污染风险高，占6.25%（4/64）；红花、夏枯草和部分菊花饮片耐胆盐革兰阴性菌污染风险中等，占4.69%（3/64），其余中药饮片的耐胆盐革兰阴性菌污染风险低，占89.06%（57/64）。

枸杞等10个品种中药饮片调查结果的风险评估结果见表3（其中不同组别与表2 中饮片数字相对应），其中7个品种完全一致，说明中药饮片的耐胆盐革兰阴性菌污染状况虽不同，但其风险等级可能相同，同时也说明建立的量化风险评估方法可行性较好。枸杞、麦冬和菊花饮片的风险评估结果不一致，说明此类直接口服和泡服的饮片耐胆盐革兰阴性菌分布种类和数量分布不均，也说明建立的方法尚存在一定局限性；同时存在高、中风险和低风险，说明采取措施进行适当微生物控制完全可降至低风险等级，实现中药饮片耐胆盐革兰阴性菌指标的控制。

表3 10种中药饮片的风险评估结果分析Tab.3 Results of risk assessment of ten TCM decoction pieces

中药饮片耐胆盐革兰阴性菌的污染途径及传递过程分析见图1。降低污染风险的措施，主要为需关注源头和过程的引入及过程中的生长繁殖，其中炮制、加工、贮藏和流通是降低风险的关键过程。

图1 中药饮片耐胆盐革兰阴性菌的来源与传递Fig.1 Source and transmission of bile salt-resistant Gram-negative bacteria in TCM decoction pieces

3 讨论

2020 年版《中国药典》对直接口服和泡服饮片提出了耐胆盐革兰阴性菌的控制要求，对煎煮类饮片未作要求，但从中药饮片微生物风险评估角度看，应对中药饮片总体进行全面评估。尽管中药饮片煎煮后其耐胆盐革兰阴性菌会减少甚至被杀灭，但当生物负载过高时其毒素残留会增加且微生物不能被完全杀灭的可能性增加，同样也会带来安全风险。因此，本研究中在风险评估时适度参考了2020年版《中国药典（四部）》通则1107 非无菌药品微生物限度标准中对直接口服和泡服的中药饮片耐胆盐革兰阴性菌的要求，从严重性出发设定了煎煮类饮片风险等级的参考值。

近年来文献积累的数据为评估中药饮片耐胆盐革兰阴性菌的安全风险提供了可能。耐胆盐革兰阴性菌对中药饮片造成风险严重性的确定较复杂，考虑合规性，致病性和给药途径尚无法全面反映安全风险，可能会影响评估结果的准确性。如从饮片用量角度分析，目前中药饮片的用量普遍较大，陈玉欢等［26］对12 家中医院的饮片处方量调查显示，中药饮片处方平均剂量为129.60～245.00 g，平均药味数为12～18 味，使实际中中药饮片耐胆盐革兰阴性菌风险更复杂，增加了全面风险评估的难度。近年来，以质量与安全为核心的质量等级评价模式构建正在逐渐形成［27］，而其关键质量指标的选择考虑仍主要是理化指标，对微生物方面的考虑不足，量化风险评估模型的建立是对现有外源性有害物风险评估模型的补充。而量化评估方法作为中药饮片微生物风险评估的新模式，为采取措施降低风险与合理控制创造了条件。

中药饮片过高的生物负载可使耐胆盐革兰阴性菌的部分微生物逃逸煎煮过程的杀灭，从而残留在药液中，如该药液未及时用完，可能会在药液中生长繁殖，造成“耐热菌”的假象。根据本研究中量化风险评估结果，可以有针对性地对某些易导致耐胆盐革兰阴性菌污染的品种及过程进行控制，降低生物负载。耐胆盐革兰阴性菌的生长繁殖通常需要较高的水分，在炮制、贮藏、流通等环节采取措施控制水分，是防止微生物生长繁殖的重要途径。在炮制环节关注中药材及饮片自身的吸湿性能［28］，李琼琼等［6］的调查显示，经净制、干燥等简单炮制工艺的饮片中耐胆盐革兰阴性菌检出率远高于炮制工艺包含热处理的饮片。规范化流通和贮藏是降低耐胆盐革兰阴性菌生长繁殖的关键环节之一［29］。如山楂、桔梗、补骨脂、麻黄等药材有返潮或吸潮现象，水分含量超标较严重［30］，环境及预防措施不到位导致污染微生物生长繁殖［31］，探讨水分、水分活度与微生物生长的关系，通过控制中药饮片水分，解决中药饮片在贮藏、运输过程中微生物的过度增殖，可加强中药饮片耐胆盐革兰阴性菌的控制［32］。