生物气溶胶采样器采样效率计量评价方法研究进展

刘文成, 傅博强, 刘乃毓, 李曼莉, 牛春艳,王 晶, 伍义行, 李 茹, 程 环

(1.中国计量大学 生命科学学院，浙江 杭州 310018； 2.中国计量科学研究院，北京 100029；3.西安工程大学 环境与化学工程学院，陕西 西安 710600；4.军事科学院军事医学研究院 科研保障中心，北京 100850)

1 引 言

生物气溶胶是指含有微生物或生物大分子等生命活性物质的液态或固态微粒悬浮在气体介质中形成的分散体系[1]。生物性微粒包含细菌、真菌、真菌毒素、病毒、孢子、花粉、尘螨、衣原体、支原体、立克次体、多肽及各种动植物裂解碎片等,其空气动力学粒径范围为0.01～100 μm[2]。生物气溶胶具有远距离传播性、易再生性等特点,一般通过呼吸道进入人体[3],可引起呼吸道疾病、传染性疾病、过敏等[4]。

据统计,世界上已发现的500多种致病菌中,至少有100多种经气溶胶传播,因此气溶胶传播已成为致病菌最主要的传播途径之一[5]。研究表明,全球每年因含微生物气溶胶引起的呼吸道感染率高达20%[6]。例如2003年流行性非典型肺炎(SARS)、2009年甲型H1N1流感、2012年的中东呼吸综合症(MERS)、2019年底爆发的新型冠状病毒(COVID-19)及其变异株等都是通过气溶胶中的病毒进入人体呼吸系统从而导致大范围的感染[7～9]。

由于生物气溶胶带来的健康危害,引起了科研人员对空气传播病原体微生物采集监测的重视,开发了液体冲击式、固体撞击式、气旋式、过滤式和静电式等多种不同采集原理的生物气溶胶采样器。但由于微生物具有多样性的特点,导致不同设计原理的仪器对不同生物气溶胶粒子的采样物理效率和采样生物效率存在差异,选择合适的生物气溶胶采样器是了解环境中生物气溶胶的种类、成分和浓度评估其危害的关键。因此对生物气溶胶采样器效率进行准确的计量评价意义重大。基于此,本文对目前关于生物气溶胶采样器的采样物理效率和采样生物效率评价方法进行了分析和综述。

2 生物气溶胶采样器的种类和原理

生物气溶胶采样器根据其原理可分为液体冲击式、固体撞击式、气旋式、过滤式、离心式和静电式。

液体冲击式采样器是利用喷射气流,将采集的气溶胶粒子以一定的速度喷出,生物粒子因惯性作用被收集到以缓冲盐溶液或非蒸发性液体如矿物油为采样介质的小体积采样液中[10～12]。其中AGI-30(all glass impinger-30)采样器是国际空气生物学会(International Association for Aerobiology)推荐使用的标准采样器,采样流量为12.5 L/min,冲击流速达到265.2 m/s[13,14],代表性仪器有Porton、AGI-30、Shipe、BioSampler和多级的液体冲击式采样器。

固体撞击式采样器是将获得足够惯性的气溶胶粒子通过喷嘴引导,脱离气流,撞击垂直于喷嘴出口的固体表面(营养琼脂、粘性介质等)进行收集[15]。其中安德森(Andersen)六级采样器被国际空气生物学会确定为监测空气微生物生物粒子的标准采样器,采样流量为28.3 L/min[14,15],其各级可捕获的微粒直径为从7.0～0.65 μm,冲击速度依次由 1.1 m/s 逐级升高至12.8 m/s[16]。目前,代表性仪器有单级的Casella裂隙式、Bourdillon裂隙式;多级的安德森(Andersen)六级筛孔式、Aerotech N-6。

气旋式采样器是利用旋风装置将气溶胶中的粒子以直角切线方向引入采样器,冲击由切向旋转的高速气流带动底部液体形成的连续液态膜,借助离心力和冲洗收集到储存部件中[17]。采样流量一般很大,如Bertin公司的Coriolis μ型气旋式采样器,采气流量可达300 L/min[18],此外代表性仪器还有Spin-Con型、Bio-Guardian型、Burkard型、SASS(smart air sampler system)型等。

过滤式采样器是把通过采样器的生物颗粒截留在滤膜上,从而达到采集目的。采集是由扩散、拦截、惯性撞击、重力沉降和静电吸引这5种聚集机制同时作用的结果[19]。截留滤膜可分为水溶性明胶滤膜、藻酸钠滤膜,水不溶性聚碳酸脂膜、硝酸纤维素酯膜、醋酸纤维膜、MEC混合纤维酯膜等[20]。滤膜孔隙一般为0.01～10 μm,采样流量1～50 L/min,代表性仪器有Sartorius MD8、MF-45型采样器等。

离心式采样器是利用涡壳内叶轮的高速转动将前方40 cm内的空气吸入,微生物粒子在离心力的作用下被冲击在特制的琼脂培养基条上,采样流量恒定为40 L/min,采样时间在6 min以内[21],此类代表性采样器为RCS型和LWC-Ⅰ型。

静电式采样器是利用带电的气溶胶粒子在高压电场力的作用下发生静电吸引从而被富集到采样载体上[22]。可分为利用粒子自然带电的静电沉降式采样器和在采样器入口处为粒子充电的静电吸附式采样器[23]。代表性仪器有LVS/10K大容量静电沉降采样器、离子充电型静电采样器、疏水表面静电采样器等。

不同原理生物气溶胶采样器的性能对比见表1。

表1 不同原理生物气溶胶采样器的性能对比Tab.1 Performance comparisons of bioaerosol sampler with different principles

3 采样物理效率

采样物理效率是指采样器对不同粒径粒子的采集效率。粒子可以是微生物、携带微生物的粒子或无生命力的粒子。对相同粒径的以上粒子,采样物理效率相同[24,25]。采样器对某粒径气溶胶采集物理效率为50%时的粒径称为切割点。

3.1 含菌粒子比较法

中国计量科学研究院与河北省计量监督检测研究院共同主持起草的JJF 1826—2020空气微生物采样器校准规范中,针对安德森撞击法原理采样器,建立了在校准仓内产生多种单一粒径的含菌气溶胶粒子,基于水溶性凝胶滤膜采样器比较法的采样物理效率计量评价方法。

(1)

该方法的特点在于产生的不同单一粒径的粒子含有活菌孢子,可以最大程度的模拟自然环境中的气溶胶粒子,通过与对粒子截留效率高达99.9%以上的滤膜法采样器进行比较,计算采样物理效率,且通过多次实验增加了实验的准确性。

3.2 惰性粒子浓度比较法

GB/T 39990—2021中给出了一种基于惰性粒子和滤膜采样器比较的采样物理效率评价方法。将粒径为1、3、5、10 μm的单分散荧光聚苯乙烯微球作为气溶胶粒子雾化于采样校准舱5 min至粒子悬浮,当待测采样器与滤膜采样器的采样口粒子浓度相同时,同时采样5 min。结束后用30 mL去离子水将二者采集的颗粒洗脱,用荧光分光光度计测量待测采样器的荧光浓度(Cout)和滤膜过滤式采样器的荧光浓度(Cinlet),以1 μm的粒子为例,按照式(2),代入待测采样器的采样流量(Qout)和滤膜过滤式采样器的采样流量(Qinlet),计算待测采样器的采样效率(η1 μm)[26]:

(2)

An 等[27]采用非生物性粒子包括多分散性油酸粒子和氯化钾粒子,通过激光粒子计数器或空气动力学粒径谱仪测定被测采样器的上游粒子浓度(Cup)和下游的粒子浓度(Cdown),按式(3)计算采样物理效率(ECOLL,RCS):

ECOLL,RCS=1-Cdown/Cup

(3)

同时,以液体冲击式BioSampler采样器为参考,同样方法得到其采样物理效率ECOLL,RCS,二者相除,得到被测采样器的相对采样物理效率。

刘佳琪等[28]以无荧光单分散聚苯乙烯微球模拟不同粒径气溶胶粒子,采用空气动力学粒径谱仪测量未经采样的参比管路中的上游粒子浓度,测量被测的Andersen六级采样器出口的下游粒子浓度,按与公式(3)相同的公式计算采样物理效率。

Kesavan 等[29]通过产生惰性的多分散氧化铝颗粒和液态荧光油酸颗粒(粒径3.2,5.8,7.5,9.7,10.7和14.1 μm)的气溶胶,以滤膜采样器作为参比,同时采集。Coulter计数器和荧光计分别测定采集液内和滤膜上的氧化铝粒子和荧光粒子的数量(NC),根据取样体积(VS)以及参比采样器测得的舱内氧化铝粒子或荧光粒子的浓度(Cair),以式(4)计算其采样(物理)效率(η):

(4)

相比以微生物为气溶胶,以上方法可以准确控制气溶胶粒子的粒径大小,减少了可能因微生物活率受影响而引起的误差,缩短了实验周期。但非生物性粒子无法完全代替空气中生物性粒子;对于撞击式采样器,惰性粒子撞击在培养基或滤膜上不易洗脱,会有较多残留,导致采样物理效率测定值偏低。国家标准中未规定滤膜采样器采用的滤膜种类,不同滤膜对聚苯乙烯微球的吸附回收效果是不同的,会导致结果差异;通过荧光分光光度计测量荧光浓度来计算采集到的单分散荧光聚苯乙烯微球的数量,会受等量标准荧光素分子数/微球、背景荧光等的影响,导致计数结果产生较大不确定度。

不同原理的采样物理效率评价方法的对比见表2。

表2 不同采样物理效率评价方法对比Tab.2 Comparisons of different methods for sampling physical efficiency evaluation

4 采样生物效率

采样生物效率一般指在规定的采样条件(如采样流量、特定微生物种类、微生物浓度、采样时间等)下,所采集到的可培养微生物粒子量占其总量的百分数,又称为微生物存活率。

采样生物效率评价实验一般在气溶胶实验仓内采用人工气溶胶发生法模拟自然环境进行,以控制气溶胶粒子的微生物种类、浓度、粒径,减少外界诸多不可控因素的影响。

4.1 标准采样器对比培养法

如前所述,Andersen六级固体撞击式采样器和液体冲击式AGI-30采样器被国际空气生物学会推荐为监测空气微生物生物粒子的标准采样器,可作为参比用于其它类型生物气溶胶采样器采样生物效率的评价。

杨文慧等[30]将中值粒径为(1.60±1.08) μm的粘质沙雷菌制成悬液雾化至实验仓,以Andersen六级采样器为参比标准,对5种空气微生物采样器(Andersen二级采样器、AGI-30玻璃液体采样器、Merck MAS-100采样器、LWC-1采样器、过滤式采样器)进行平行采样,将它们与参比采样器采集的菌量的比值作为待测采样器的采样生物效率。除Andersen二级采样器与Andersen六级采样器较高以外,其余采样器均低于两者。该实验中的粘质沙雷菌的中值粒径属于人体可吸入颗粒范围,较好的模拟了自然环境,具有一定的医学意义。

液体介质采集对脆弱的微生物具有一定保护作用,杜艳艳等[31]用白色假丝酵母菌产生气溶胶,以AGI-30采样器为标准,评价自制静电采样器的采样效率。有研究表明AGI-30采样器采集时间过长时准确性会下降,Tolchinsky等[32]只以AGI-30采样器采样前5min时的数据作为参比。Dybwad 等[33]以革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、细菌孢子和病毒为对象,评估了9种不同采样器(撞击式、液体冲击式、旋风分离器式、静电式、过滤式)相对于采用高效玻璃冲击瓶捕集的BioSampler采样器的基于端到端培养测定的采样生物效率。结果表明,不同采样器存在显著差异,这取决于生物气溶胶的压力敏感性和颗粒大小,干式采样器比湿式具有更低的采样生物效率。

GB/T 39990—2021中推荐将粘质沙雷菌有证标准物质、噬菌体PhiX174有证标准物质、萎缩芽孢杆菌有证标准物质等指示微生物配制成浓度为 104～105CFU/mL的菌液产生气溶胶粒子,将采样口等高的待测采样器与参照标准采样器(Andersen六级采样器或AGI-30采样器)各采样1 min,进行比较。该方法的改进在于在2个采样器的气路的出口处分别再连接一个滤膜过滤式采样器,捕集未被两个采样器采集到而逃逸的微生物粒子。计算2个采样器各自的微生物存活率(存活率=采样器采集粒子数/(采样器采集粒子数+采样器连接处滤膜采集粒子数)),即待测采样器存活率(Stest-eff)和标准采样器存活率(Sref-eff)。之后按照式(5)计算相对存活率(Sre)即生物采样效率(η)[26]:

(5)

该方法在采样气路末端增加滤膜过滤式采样器,减少了采样过程中菌的损失,但需要增加一些附属抽气设备和气路的连接改造,以连接2个外部滤膜过滤式采样器。

An等[27]采用枯草芽孢杆菌黑色变种孢子及其营养细胞,以BioSampler为参考采样器,培养计数后,按照式(6)中的相对CFU计数值RCC(relative CFU count),计算离心式RCS型高流量采样器的相对采样生物效率RBE(relative biological efficiency):

(6)

式中:CUP,RCS和CUP,BIO分别为RCS高流量采样器和BioSampler采样器的上游的空气中粒子浓度;tRCS和tBIO分别为RCS高流量采样器和BioSampler采样器的采样时间;QRCS和QBIO为相应的采样流量。

4.2 示踪剂生物效率评价法

将示踪剂与微生物粒子混合同时产生气溶胶进行采集,示踪剂的采集效率只受物理效率影响,无关微生物存活,以采集到的微生物浓度和示踪剂的比值来表示待测采样器的生物效率。Zhao等[34]以荧光素钠作为示踪剂,与粪肠球菌、大肠杆菌、空肠弯曲菌和滑膜分枝杆菌同时雾化产生气溶胶,使用Andersen六级、AGI-30、OMNI-3000和Airport MD8采样器对其进行收集,荧光检测器检测示踪剂浓度,以式(7)计算各采样器对细菌的采样生物效率(Eb):

(7)

式中:Csample,culturable为空气中雾化采集0 min时的可培养菌的浓度;Csuspension,culturable为菌悬液中可培养菌的浓度;Csample,tracer:空气雾化0 min时荧光素钠的浓度;Csuspension,tracer为菌悬液中的荧光素钠的浓度;m为雾化事件数(粪肠杆菌4例,其他细菌3例);A为雾化过程中可培养细菌的百分比。结果表明AGI-30对所有菌的采样生物效率均较高。由于示踪剂粒子和微生物粒子粒径的差异,会导致二者采样物理效率不同,从而引入采样生物效率测量的不确定度。

4.3 基于ATP生物发光评价法

三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)存在于几乎任何生物体中,其生物发光量与存活生物量成正比,可通过如光度计等仪器对采集液中的ATP含量进行测定,是检验存活生物量的一种较为方便的方法。Han等[35]用疏水表面静电采样器对ATP含量较高的真菌孢子进行采集,并通过空气动力学粒度分析仪和ATP法,基于发光强度与孢子浓度的特异性校准曲线,测定悬浮液中的孢子数量,以式(8)计算采样效率(η):

(8)

式中:Nsample,ATP为ATP法测定的液滴中采集的孢子数量;RAPS为空气动力学粒度分析仪在10 min取样时间内每20秒测定的平均孢子浓度,cm-3;Qs为采样器的采样流速,L/min;t为采样时间,min。

4.4 基于qPCR的评价法

郭建树等[36]将采集的粘质沙雷菌和大肠埃希菌噬菌体PhiX174气溶胶粒子以qPCR的方法检测其拷贝数浓度,以公式(9)计算自制湿壁气旋式采样器的总生物效率(ηtotal)。

(9)

式中:CAGI-30为AGI-30采样器采集的细菌基因qPCR循环数;Ctest为湿壁气旋式采样器采集的细菌基因qPCR循环数;Vtest为湿壁气旋式采样器采集液体积,mL;VAGI-30为AGI-30采样器采集液体积,mL。

核酸的提取效率、基质中的抑制PCR扩增的成分、核酸的降解[37],会影响对核酸的定量准确性。最大的问题是无法区分死活菌。Tseng 等[38]使用可选择性穿透死细胞受损细胞膜并与DNA发生共价交联进而阻止PCR扩增的叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA),结合qPCR实现了空气中金黄色葡萄球菌死活菌的区分定量。评估了3种采样器(AGI-30冲击采样器、BioSampler和Nuclepore过滤器采样器)的采样生物效率。采用qPCR法测定金黄色葡萄球菌细胞总浓度,PMA-qPCR法测定活细胞浓度。

但将PMA-qPCR方法应用于实际采样前必须考虑生物气溶胶浓度、光照条件、扩增子的长度、DNA序列、pH值等可能影响PMA-qPCR效率的因素[39]。

4.5 绝对采样生物效率评价方法

针对以往采样生物效率评价方法都是针对参比采样器进行比较得到的相对采样生物效率的问题,Pogner等[40]使用一种基于层流的新型生物气溶胶测试系统,产生长枝木霉、产红青霉、巴西曲霉、枝孢样枝孢霉、解淀粉芽孢杆菌的孢子的气溶胶,通过激光粒子计数和基于显微镜和培养相结合的技术对3个采样点的孢子浓度进行测定,评价了7种采样器的“绝对”采样生物效率。

在监测点1,用显微镜计数初始悬液中的孢子数SC,并通过稀释涂抹法测定CFU,计算其可培养性CR。

(10)

在监测点2,测定CR,评估雾化过程对细胞活力的影响。在监测点3,采用6通道粒子计数器,对粒径0.3～5.0 μm的孢子进行计数。

(11)

式中:SCe为监测点3的预期孢子数,m-3;SCi为起始悬浮液中的初始孢子数,mL-1;0.19为雾化率,min-1;1.16为标准条件下舱内气流流量,m3/min。

监测点3的预期CFU的数量:

CFUe=SCe×CRCMP2

(12)

CFUe为监测点3的预期,m-3,CRCMP2为监测点2孢子雾化后的可培养性。

BSE为采样器实际测得的CFUm与预期的CFUe之比。

(13)

不同原理的采样生物效率评价方法的对比见表3。

表3 不同采样生物效率评价方法对比Tab.3 Comparisons of different methods for sampling biological efficiency evaluation

5 问题及展望

在对采样器采样物理效率和采样生物效率进行计量评价时,应当结合实际情况,选择科学、简便可靠、不确定度小、成本可控的评价方法,严格控制实验条件,并进行足够的重复次数,以保证评价结果的准确可靠。

采样物理效率评价方法中,基于人工生物粒子的滤膜采样器比较法接近真实环境,但操作较复杂。以惰性聚合物粒子作为气溶胶的上下游粒子浓度比较法中气溶胶粒径准确可控,免去培养步骤,但无法真实模拟对自然界的生物性粒子的采集。未来在新的采样物理效率评价方法开发上,可考虑将二者结合起来,在粒径可控的惰性粒子上吸附结合可培养的微生物细胞。

采样生物效率评价方法中,以Andersen六级采样器和AGI-30做为参比标准采样器的采样生物效率评价方法是目前较为主流的方法,Andersen六级不利于大粒径粒子收集的劣势和AGI-30不利于小粒径收集的特点,二者某种程度上可以互补。因为参比采样器本身的采样生物效率并不能达到100%,因此使评价结果存现偏差。无需参比采样器的绝对生物效率评价方法代表了未来的发展方向,但其在活菌绝对浓度的准确定量上面临挑战。