参苓白术散调控TLR4/NF-κB 通路抑制LPS 诱导心肌细胞炎性损伤的机制

黄 娟，王一阳，肖 凡，刘 秀，喻 嵘*

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy, DCM）是糖尿病主要的心血管并发症之一，是糖尿病患者心力衰竭高发生率和高死亡率的主要病因[1-2]。 目前，DCM 的发病机制及诊治方面的研究尚有许多未知领域和难点。 近年研究认为，DCM 是心肌在长期高血糖状态下发生的一种慢性炎症性疾病[3]。 研究报道，糖尿病患者的血清和糖尿病动物模型的心肌组织中，多种炎症因子的表达水平显著升高[4-5]。因此，早期抑制炎症级联反应是防治DCM 的一个新靶点。 Toll 样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）作为炎症反应的重要受体及机体免疫防御系统中的重要组成，是免疫反应与慢性炎症的桥梁[6]。 但TLR4是否介导DCM 早期炎症损伤的发生发展，需要进一步探究。

新近研究表明，肠道菌群具有内分泌器官的特征，可通过调节机体代谢及免疫炎症反应影响糖尿病心肌病的病理进程[7]。 肠道微生物群落参与机体免疫细胞的分化成熟，生理状态下，肠上皮细胞结构完整并通过宿主模式识别受体，调控菌群结构，维持内环境稳态；当肠黏膜屏障损伤时，通透性增加，大量促炎物质[如脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）]通过通透性升高的肠屏障进入血液循环到达心脏组织，直接激活TLR4 相关通路，诱导病原相关模式分子信号活化，触发局部炎症级联反应；另一方面，心肌细胞功能缺失，并出现大量细胞死亡，与黏附因子相互作用产生炎症效应，引起心肌纤维化及心室重构等病理状态出现[8-9]。 前期临床研究表明，以益气健脾立法组方的参苓白术散可调节糖脂代谢，对心血管疾病疗效确切[10]。 同时，体内实验证实，其可改善脂代谢和减少肠道炎症因子释放，减缓血管病变的风险，抑制免疫炎症反应过度损伤，但其靶向调控心血管的机制需要进一步研究[11-12]。 故本研究进行体外细胞实验研究，拟以心肌细胞作为研究对象，从免疫炎症角度出发，探讨参苓白术散含药血清对肠道代谢物LPS 介导的TLR4/核因子κB（nu clear factor-κB, NF-κB）信号通路及炎症相关因子白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）表达的影响。

1 材料

1.1 动物与细胞株

20 只8 周龄SD 雄性大鼠，体质量200～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK（湘）2019-0004，于湖南中医药大学第一附属医院实验动物中心进行饲养；温度（22±2） ℃，湿度50%～65%，自由饮食、饮水，12 h/12 h光/暗周期（光照时间为6:00～18:00）。 本研究经湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准，批准号：430727221101382931。 大鼠H9C2 心肌细胞（批号：CL-0089），购自武汉普诺赛生物科技有限公司。

1.2 药物

参苓白术散由人参、茯苓、白术（炒）、山药、白扁豆（炒）、莲子、薏苡仁（炒）、砂仁、桔梗、甘草组成，批号：22101037，国药准字号：Z110020755，购自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂。

1.3 主要试剂与仪器

胎牛血清（批号：SA210518）、胰蛋白酶-EDTA消化液（批号：WH0221A171）、高糖DMEM 培养基（批号：WH0022P299）、PBS 缓冲液（批号：AD17792273）、CCK-8 检测试剂盒（批号：AI07246697）、无血清细胞冻存液（批号：WH0221A091）均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；兔抗TLR4 多克隆抗体（批号：ab13556）、兔抗核因子κB p56（nuclear factor-κB p56,NF-κB p56）单克隆抗体（批号：ab207297）、兔抗NFκB 抑制蛋白α（degradation of protein κB-α, IκBα）单克隆抗体（批号：ab32518）；兔抗TNF-α 单克隆抗体（批号：ab215188）、兔抗IL-1β 单克隆抗体（批号：ab234437）均购自英国Abcam 公司。

SW-CJ-2G 型超净工作台（美国Thermo Scientific 公司）；TGL-18R型冷冻高速离心机（德国Eppendorf公司）；YP1002N 型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；EnSpire2300 型多功能酶标分析仪（新加坡PerkinElmer 公司）；JSM-6700F 型扫描显微镜（日本Jeol 公司）。

2 方法

2.1 含药血清制备

将20 只SD 大鼠适应性喂养1 周后，随机分成2 组：空白血清组、参苓白术散含药血清组，每组10只。 给药剂量为等效剂量的5 倍，依据体表面积方法换算[13]，参苓白术散含药血清组大鼠用药剂量=（5×12 g×6.3）/70 kg=5.4 g/kg，给予参苓白术散药液灌胃；空白血清组采用等容量的灭菌超纯水灌胃，每日1 次，连续7 d。 末次灌胃1 h 后，腹主动脉取血，用含肝素抗凝管收集血液，静置3 h 后；以3 000 r·min-1离心（离心半径10 cm）15 min，收集上层血清，0.22 μm一次性滤过器过滤，56 ℃恒温水浴锅灭活30 min；将灭活的血清分装至无菌EP 管中标记，置于-80 ℃保存。

2.2 含药血清浓度筛选

取对数生长期的H9C2 细胞接种于96 孔板中，按照每孔100 μL、每孔5×103个细胞，在5%CO2、37 ℃条件下培养24 h，弃去培养基，设空白对照组、空白血清组及含药血清组，设置5%、10%、15%、20%、25%的浓度梯度。 培养24 h 后，吸弃上清液，每孔加入CCK-8 溶液10 μL 及完全培养基90 μL，2 h 后用酶标仪在450 nm 波长处检测各组细胞的OD 值。

2.3 细胞分组及处理

H9C2 细胞用10%胎牛血清DMEM 培养液调整细胞密度为5×104/mL，接种于6 孔板中，予以10 μg/mL LPS 干预处理24 h 后收集细胞。随机分成空白血清组（10%空白血清）、模型组（10 μg/mL LPS+10%空白血清）、参苓白术散含药血清组（10 μg/mL LPS+10%参苓白术散含药血清）及TAK-242组（10 μg/mL LPS+5 μmol/L TAK-242[14]）。

2.4 CCK-8 法筛选含药血清干预浓度

H9C2 细胞以5×104mL-1密度接种至96 孔板中，放入37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h；吸弃培养基后，分别加入稀释后的胎牛血清、空白血清及含药血清，每组设置5%、10%、15%、20%、25%的浓度梯度，每组均设6 个复孔。干预处理24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液及90 μL 完全培养基，培养箱孵育2 h 后采用酶标仪在450 nm 波长下检测各组细胞的OD 值。

2.5 ELISA 法检测细胞IL-1β、TNF-α 含量

取生长良好的H9C2 细胞按照分组干预后，吸取细胞上清液，以3 000 r·min-1（离心半径15 cm）离心20 min，取上清液检测。 分别设空白孔、待测样品孔。 在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；每孔加入酶标试剂100 μL，空白孔除外；用封板膜封板后置37 ℃温育60 min；弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s 后弃去；每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min；加终止液50 μL，终止反应；以空白孔调零，450 nm 波长依序测量各孔的OD 值，计算IL-1β、TNF-α 含量变化。

2.6 免疫荧光法检测IL-1β、TNF-α 蛋白表达

将H9C2 细胞按照每孔1×105个细胞接种于含细胞爬片的6 孔板。按照分组加入相应药物干预，培养24 h 后，以4%预冷的多聚甲醛溶液对细胞进行固定（15 min），PBS 溶液洗3 遍后加入5% BSA 封闭30 min，加入稀释的IL-1β、TNF-α（1∶50）一抗孵育过夜；滴加稀释的IgG/FITC 二抗孵育60 min；洗涤后复染核，然后进行封片，荧光显微镜下观察。

2.7 Western blot 法检测TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表达

将H9C2 细胞以5×105/mL 的细胞密度接种于6孔板中，细胞培养24 h 后，按照分组加入相应药物干预，培养24 h 后，弃培养上清液，用PBS 洗涤2次，加入适量RIPA 裂解液重悬；低温下匀浆后将样品转移至1.5 mL 离心管中，以12 000 r·min-1（离心半径10 cm）离心5 min，取上清液分装。 采用BCA法测定蛋白浓度后，进行丙烯酰胺凝胶电泳，转膜切胶后封闭，加入一抗TLR4（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、IκBα（1∶1 000）抗体，4 ℃下孵育过夜；PBST洗膜3 次，加入HRP 标记的山羊抗鼠IgG（1∶5 000）、山羊抗兔IgG（1∶5 000）二抗，室温孵育90 min。PBST洗膜3 次，ECL 显色液中显影1 min，冲洗胶片、扫描。

2.8 统计学方法

采用SPSS 22.0 进行统计处理。 计量资料满足正态性和方差齐性者用“±s”表示，多组间比较用单因素方差分析，组间比较用LSD 检验；不满足正态性和方差齐性者用Tamhane's T2 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 参苓白术散含药血清对H9C2 细胞增殖的影响

与空白对照组相比，参苓白术散含药血清组及空白血清组在10%浓度水平的OD 值差异无统计学意义（P＞0.05）；而参苓白术散血清浓度为5%、15%、20%、25%时，OD 值明显降低，细胞增殖受到抑制，差异有统计学意义（P＜0.01）。 结果表明，10%参苓白术散含药血清对H9C2 细胞无明显毒性作用，故以此浓度作为后续实验含药血清的干预浓度。详见图1。

图1 各组H9C2 细胞增殖情况比较（±s，n=6）

3.2 参苓白术散含药血清对H9C2 细胞中TNF-α、IL-1β 水平的影响

与空白血清组相比，模型组H9C2 细胞释放的TNF-α、IL-1β 含量增加（P＜0.01）。 与模型组相比，参苓白术散含药血清组及TAK-242 组细胞中的TNF-α、IL-1β 含量显著降低（P＜0.01）。 详见图2。

图2 各组H9C2 细胞中TNF-α、IL-1β 水平比较（±s，n=6）

3.3 参苓白术散含药血清对H9C2 细胞IL-1β、TNF-α 蛋白表达的影响

与空白血清组比较，模型组H9C2 细胞的IL-1β、TNF-α 的平均OD 值明显增加（P＜0.01）。与模型组比较，参苓白术散含药血清组及TAK-242 组细胞的IL-1β、TNF-α 平均OD 值明显下降（P＜0.01）。 详见图3。

图3 各组H9C2 细胞IL-1β、TNF-α 蛋白表达比较（±s，n=6）

3.4 参苓白术散含药血清对H9C2 细胞TLR4、NFκB p65、IκBα 蛋白表达的影响

与空白血清组相比，模型组H9C2 细胞内TLR4、NF-κB p65、IκBα 蛋白表达显著增加（P＜0.01）。 与模型组相比，参苓白术散含药血清组及TAK-242 组细胞的TLR4、NF-κB p65、IκBα 蛋白表达减少（P＜0.01）。详见图4。

图4 各组H9C2 细胞TLR4、NF-κB p65、IκBα 蛋白表达比较（±s，n=6）

4 讨论

据最新国际糖尿病联盟的数据统计，目前全球约有4.25 亿糖尿病患者，且呈现逐年上升的趋势，预计到2045 年将达到7 亿[15]。持续的血糖增高可诱导机体代谢紊乱、免疫炎症反应及氧化应激等多种病理状态出现，引起机体组织及细胞的损伤，而糖尿病心血管并发症是糖尿病患者的主要死亡原因[16]。DCM 是糖尿病常见并发症之一，是独立于冠心病及高血压的特异性心肌病，其发病机制尚未完全阐明。糖尿病心肌病既有“消渴”症状，也存在“心病”表现。中医学认为，先天不足或后天失养及他脏病变累及脾胃，可导致其胃火偏盛，脾阴亏损，运化不能，气机失畅，水谷精微疏布失常，痰浊内生。病程迁延不愈，气阴耗伤，久病内舍于心，心气不足，运血无力，心阴亏虚，则燥热内盛，暗耗心血，瘀滞内生。 脾不散精是DCM 的中医病机关键，故选用参苓白术散，探究从脾治心的科学内涵。 方中君药人参、白术、茯苓益气健脾，渗湿化浊；臣以莲子、山药补气生津；合用白扁豆、薏苡仁、砂仁健脾渗湿，行气化滞；桔梗宣通肺气，载药上行于心肺为佐；甘草健脾和中，调和诸药。 全方以补中气、渗湿浊、行气滞为要。 近年来，随着肠道微生态相关内容的研究深入，发现肠道菌群与DCM 的发生密切相关[17-18]。 肠道菌群与宿主免疫系统相互协调平衡，维持机体内环境稳态。 正常状态下，肠道屏障功能能够抑制病原微生物的蓄积及移位，并通过宿主模式识别受体（pattern recognition receptor, PRR）感知微生物的异常活动，激活免疫反应识别清除；而病理情况下，出现肠道渗漏、肠屏障功能降低、肠道通透性升高，伴随肠道菌群丰度及结构变化，可触发局部炎症反应，大量释放的炎症因子可进入循环，发生移位，靶向损伤心肌细胞[19-20]。微生物相关模式分子和LPS 是肠道菌群与宿主相互作用的主要介质，可与PRR 识别结合，直接作用于免疫系统，并诱导炎症级联反应，促进DCM 的发生发展。

TLR4 是一种广泛表达于心肌细胞表面的PRR，可响应不同病原相关分子模式，启动识别、靶向结合并诱导一系列的信号传输，在机体内环境免疫炎症调控中具有重要作用，与心血管疾病紧密相关[21-22]。 持续的代谢紊乱状态及氧化应激可触发机体免疫炎症反应，TLR4 可识别并激活机体的免疫细胞，促使炎症介质及趋化因子释放，同时活化经典的下游炎症信号转录因子NF-κB。 在静息状态下，NF-κB 常以2 个亚单位p65 和p50 结合成异源二聚体，与IκB 抑制蛋白家族结合，形成一个稳定的三聚体，存在于细胞质中[23-24]。IκBα 是IκB 家族中的一员，是NF-κB 蛋白的主要抑制剂，当受到细胞外信号刺激时，IκBα 发生泛素化、磷酸化并降解，IκB从三聚体中解离出来，释放p65/p50，进行核移位，使其移至细胞核与靶基因启动区或增强子的NFκB p65 位点结合，上调IL-6、IL-8、TNF-α 等促炎因子的表达[25-26]。 IL-1β、TNF-α 可协同介导免疫炎症反应的级联放大[27]。 IL-1β 是炎性反应启动因子，应激状态下，以前体形式剪切活化，IL-1β 释放增加可促进血管细胞分泌大量的黏附因子，介导氧自由基及炎性递质蓄积[28]。 同时，可上调TNF-α 的合成与表达，激活凋亡通路，加快心肌细胞凋亡[29-30]。 本研究以LPS 作为诱导剂，模拟“肠漏”状态下，LPS 通过循环诱导心肌细胞炎症损伤的过程。 采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率，筛选含药血清浓度，10%参苓白术散含药血清对细胞增殖状态无明显影响，故选做实验含药血清干预浓度。 研究结果显示，参苓白术散含药血清可有效抑制H9C2 细胞中TNF-α、IL-1β 的含量，降低炎症因子的释放。 H9C2 细胞在LPS 刺激后，可激活炎症相关通路，参与细胞炎性损伤过程。 本研究中，与空白血清组比较，LPS 诱导的模型组H9C2 细胞TLR4、NF-κB p65、IκBα 及TNF-α、IL-1β 蛋白表达明显上调，继发的炎性反应明显。 而参苓白术散含药血清可抑制TLR4/NF-κB通路蛋白表达，其中NF-κB p65 活化后的核移位效应可促进成熟的IL-1β、TNF-α 蛋白表达变化，并促进其分泌至细胞外，引起炎性反应，其作用效应与TLR4 抑制剂相当。 参苓白术散含药血清组IL-1β、TNF-α 蛋白表达差异与TLR4、NF-κB p65、IκBα 的结果具有一致性。

综上所述，参苓白术散含药血清可能通过细胞炎症信号通路TLR4/NF-κB，抑制炎症因子TNF-α、IL-1β 的释放与表达，阻断慢性炎性反应的持续过程，维持心肌细胞正常功能状态。本研究进一步验证参苓白术散通过抑制炎症机制调控LPS 对心肌细胞的损伤效应，为临床诊疗DCM 的应用提供依据。