小檗碱下调NLRP3减轻PC12细胞缺氧缺糖/复氧复糖损伤的作用

李 强， 沈琳娜， 刘 冲， 古亚伟， 王利军

细胞焦亡与炎性因子的释放有关，是近年来人类发现的细胞程序性死亡方式，不同于细胞凋亡及坏死性凋亡，当生物体受到毒性刺激时，有害的细胞内和细胞外信号就会被诱导通过经典的焦亡途径在细胞质中形成炎症小体，该途径依赖于非经典的焦亡通路，对于中枢神经系统疾病中，这种细胞死亡方式非常普遍，尤其是具有高发病率的阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）、癫痫等均会出现细胞焦亡；抑制炎症级联反应是改善脑缺血再灌注损伤的理想策略；小檗碱（berberine，BBR）已被证明具有许多药理活性和良好的安全性，如镇痛、抗炎和抗癌；很多的研究结果显示，BBR能保护脑缺血再灌注损伤；小檗碱可以通过抑制氧化应激，减轻炎症反应，提高免疫功能，抑制NF-κB/NLRP3信号通路，减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤；小檗碱预处理缺氧缺糖/复氧复糖（hypoxia/reoxygenation，OGD/R）诱导的PC12 细胞损伤有怎样的作用？本部分对以上问题进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 PC12细胞株（由武汉普诺公司提供），CO2恒温培养箱（Panasonic），倒置荧光显微镜（广州明美光电技术有限公司），生物倒置显微镜（广州明美光电技术有限公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），RPMI 1640 培养基（biosharp），Na2S2O4（SIGMA），ELISA［大鼠白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-18］试剂盒（酶免），GSDMD（CST），NLRP3（BOSTER），CASP1（P20）（BOSTER）。

1.2 小檗碱给药浓度的确定及分组 对制备好的样品根据实验分组进行加药处理，首先用1640 培养基配置盐酸小檗碱溶液：0 µmol/L、25 µmol/L、50 µmol/L、100 µmol/L、200 µmol/L、400 µmol/L、800 µmol/L及对照组，不同治疗浓度的盐酸小檗碱分别作用于PC12 细胞损伤模型，制作盐酸小檗碱的量效曲线，在此基础上，进一步得出盐酸小檗碱给药的低、高浓度。细胞分为对照组、OGD/R 损伤组、小檗碱低（25 µmol/L）、高剂量（200 µmol/L）组。小檗碱干预24 h后，通过OGD/R损伤后，检测相关指标的变化情况。

1.3 LDH 检测 收集各处理组细胞培养液，离心取上清液待测。按照试剂盒说明书溶解试剂，测试前室温下平衡至少30 min。混匀，放置于室温环境中，一段时间后取出并在450 nm 处酶标仪测定吸光值。之后按照以下方法确定出LDH的抑制率：

1.4 TUNEL 首先用4%多聚甲醛固定15 min，接着进行反复洗涤；破膜，此操作持续5 min，之后用专用洗液进行反复洗涤；于样品中加入适量的TUNEL反应液，放置于无光照的室温环境中培养，持续时长为4 h；切片于尼康荧光显微镜下观察并采集图像；经过浸染后制备而成的细胞核在紫外的激发下为蓝色；同时经过检测，发现其阳性表达为红光或者绿光。

1.5 免疫荧光 加入破膜液破膜，此操作的持续时间为10 min，之后进行反复洗涤；之后进行血清封闭，这一操作需持续10 min；加一抗、二抗、DAPI复染细胞核；爬片用弱碱性的PBS洗涤，此步骤重复3 次，每次持续时间为1 min，切片稍甩干后进行封片；切片于荧光显微镜下观察并采集图像；经过浸染后制备而成的细胞核在紫外的激发下为蓝色；同时经过检测，发现其阳性表达为绿光。

1.6 IL-1β 及IL-18 检测 按试剂盒说明书进行操作，将各种试剂移至室温环境中半小时。要是在450 nm 处依序测量各孔的吸光值。得出这一数值后，再结合标准品的浓度绘制出相应的标准曲线，进而确定出样本浓度。

1.7 蛋白质印迹（Western blotting） 提取细胞总蛋白，经制胶、电泳、凝胶转膜、封闭，加入一抗、二抗，用Image J 软件统计分析采集的图像，确定出灰度值，设置的内参为 GAPDH，进行计算分析确定出相对蛋白表达水平。

1.8 统计学分析 采用SPSS 24.0软件完成数据处理。同时本研究中用(±s)描述数据分布情况，时间差异的分析中，主要是采用重复测量方法展开分析。而进行组间对比时，则用单因素方差分析。对于本文收集的相关数据，引入LSD-t检验进行组间两两比较。另外还使用功能强大的Graphpad prism 7.05 绘制统计图，各环节中的数据检验均为双侧检验，若统计结果为P＜0.05，则表示差异显著。

2 结 果

2.1 小檗碱对OGD/R 诱导的PC12 细胞损伤后乳酸脱氢酶（LDH）活性的影响 此处结合下图展开分析，不难得出，OGD/R 损伤组与Control 组相比，前者的细胞LDH 活性显著增加，两组数据差异较大；与OGD/R 损伤组相比，给予25 µmol/L、200 µmol/L 小檗碱预处理后，能显著降低细胞中LDH活性水平，差异均具有统计学意义（见图1）。

图1 PC12细胞损伤后LDH活性的影响

2.2 小檗碱对细胞凋亡率的影响 在本环节的研究中，使用TUNEL 染色法对神经元阳性凋亡细胞进行染色。将样品放置于显微镜下观察，发现Control 组中有少量神经元TUNEL 阳性荧光染色；相较于该组，OGD/R组中有大量凋亡细胞。另外，经过进一步的观察和分析发现，其TUNEL 阳性凋亡细胞数量增多，两组数据差异较大；同时相较于损伤组而言，小檗碱处理组中，可观察到凋亡神经元减少，两组数据差异明显（见图2、图3）。

图2 四组神经细胞TUNEL染色结果（×400）

图3 小檗碱对PC12细胞凋亡的影响

2.3 小檗碱对OGD/R 诱导的PC12 细胞损伤后GSDMD 荧光表达的影响 在本环节中，首先要观察神经元内GSDMD 荧光表达，期间需要用到细胞免疫荧光染色法；由此得出的结论是：相较于Control组而言，OGD/R损伤组细胞内绿色荧光增强，两组数据差异较大；进一步的分析可知，相较于OGD/R 损伤组，预处理组细胞内绿色荧光减少，两组数据差异较大（见图4、图5）。

图4 四组神经细胞GSDMD荧光表达结果（×400）

图5 小檗碱对OGD/R诱导的PC12细胞损伤后GSDMD荧光表达的影响

2.4 小檗碱抑制OGD/R 诱导的PC12 细胞损伤后IL-1β 及IL-18 的分泌 酶联免疫法实验结果显示，对比分析OGD/R 组与空白组，发现前一组细胞培养上清中IL-1β 及IL-18 含量较多，两组数据差异显著；干预组与OGD/R 组相比，后者细胞培养上清中IL-1β及IL-18含量更低（见图6、图7）。

图6 小檗碱抑制OGD/R 诱导的PC12 细胞损伤后IL-1β 的分泌

图7 小檗碱抑制OGD/R诱导的PC12细胞损伤后IL-18的分泌

2.5 小檗碱抑制OGD/R 诱导的PC12 细胞NLRP3、GSDMD、Caspase-1 蛋白表达 Western blotting结果显示：与空白组相比，OGD/R 组大鼠海马组织NLRP3、GSDMD、Caspase-1 蛋白表达均有不同程度增加，均具有统计学意义。预处理组与OGD/R 组相比，前者中这些蛋白表达水平降低，此外两个治疗组大鼠的这些指标降幅更大，差异显著（见图8～图11）。

图8 四组NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白表达

图9 小檗碱抑制OGD/R诱导的PC12细胞GSDMD蛋白表达

图10 小檗碱抑制OGD/R诱导的PC12细胞Caspase-1 蛋白表达

图11 小檗碱抑制OGD/R诱导的PC12细胞NLRP3蛋白表达

3 讨 论

多种病理机制参与缺血性脑卒中的发病过程，包括钙失衡、兴奋性毒性、氧化应激、炎症反应和血脑屏障（blood brain barrier，BBB）破坏［1，2］；其中炎症过程是在中风的整个过程中所固有的，焦亡是一种促炎驱动的程序性细胞死亡，通常会表现为细胞肿胀、膜破裂等［3］；不同的刺激可激活它们的炎症小体，而后Caspase-1作用于IL-1β和IL-18并使这两种物质裂解；此过程中促炎半胱天蛋白酶切割GSDMD在焦亡中起着关键性作用，GSDMD裂解n端结构域对细胞具有细胞毒性，并易位到细胞膜上，诱导焦亡细胞死亡。

近年来使用OGD/R模型模拟脑梗死、脑卒中、脑缺血再灌注损伤等细胞分子水平的研究，PC12细胞是神经细胞株，有学者从大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤中将其提取出来。这类细胞在形态、生理等方面和神经元类似，且二者的性质也趋于一致；因此本研究构建体外缺血再灌注PC12 细胞模型，通过体外实验观察小檗碱对OGD/R 诱导的PC12 细胞焦亡的影响及调控机制。研究结果表明：经25 µmol/L、200 µmol/L 的小檗碱预处理的细胞其增值率显著提高，差异具有统计学意义；由此可推断出小檗碱可缓解OGD/R 诱导的PC12损伤。

LDH 则可以反映细胞膜完整性，脑组织局部供血不足时，病变细胞会释放出LDH，这种物质会穿透保护屏障而最终进入血液循环。因此细胞存活率和LDH 的漏出量是评价细胞损伤的常用指标之一［4］；此研究发现，OGD/R 诱导的PC12 细胞LDH 活性较高；因而可以认为，这种细胞OGD 细胞损伤模型有效，且小檗碱可以抑制损伤。

NOD样受体蛋白-3和先天免疫存在密切关系，可看作为一种识别受体，参与脑缺血后的炎症损伤，NLRP 的组成单元包括NLRP3、ASC 和Caspase-1。这种炎症小体的结构和功能研究已经有很多，且发现其在缺血脑组织的神经元中广泛地分布，从而介导脑缺血损伤，这就提供了一个新的方案开发和使用靶向NLRP3介导的炎症反应的药物治疗缺血性卒中；本文的实验研究结果表明NLRP3、GSDMD 相关蛋白的表达有所增加，诱导PC12细胞焦亡，这与既往文献报道相一致［5～7］，荧光检测结果同时显示，OGD/R后GSDMD表达明显增强，而小檗碱干预后使得NLRP3、GSDMD蛋白水平降低，由此也可判断出小檗碱对PC12 细胞损伤的保护作用主要是通过抑制焦亡实现。

IL-1是炎症性［8］的一种胞质蛋白，是脑缺血神经元损伤［9］的关键介质；IL-1家族中有9个成员，其中最典型的是IL-1β和IL-18，越来越多的证据表明，NLRP3组装前Caspase-1，触发一个信号级联，该信号级联对失调性细胞因子如IL-1β、IL-6 和IL-18 的产生至关重要，这些关键的炎症分子对神经元存活产生不利影响，并在卒中损伤［10］的进展中发挥不同的作用，本实验结果表明OGD/R处理后的PC12细胞中IL-1β和IL-18水平明显地提高，而小檗碱干预后这两个炎性因子的含量有一定幅度下降，由此结果可推断出小檗碱对与此相关的IL-1β和IL-18释放可起到抑制作用。一些学者的实验研究发现小鼠脑缺血再灌注时Caspase-1被激活，而通过一定的药物干预来抑制其激活，可缓解脑缺血再灌注相关的损伤［11，12］。

综上所述，小檗碱干预可阻碍NLRP3、GSDMD的激活，同时也抑制了IL-1β和IL-18分泌和释放，据此抑制了细胞焦亡，相应的炎性反应损伤也减轻。根据以上论述可知OGD/R可诱导PC12焦亡，小檗碱对这种焦亡相关的损伤有抑制作用，这主要是通过抑制神经元凋亡和炎性因子的释放实现。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：李强负责设计论文框架、起草论文及论文修改；李强、沈琳娜负责数据收集、统计学分析、绘制图表；李强、刘冲、谷亚伟负责实验操作、研究过程的实施；李强、王利军负责拟定写作思路、指导撰写文章并最后定稿。