家畜精液冷冻技术研究进展

吕艳丽，刘 刚，蒋桂荣，杨 蓉，王 燕，周 迪

（贵州省种畜禽种质测定中心，贵阳 550000）

中国畜禽遗传资源丰富，地方优良畜禽品种繁多，如北京番鸭、中山麻鸭、上海水牛、小尾寒羊、赤水竹乡鸡等。这些优良的地方畜禽品种资源对中国畜牧业发展有重要作用。随着生态环境的改变、新品种的大量引入、杂交技术的广泛应用、经济效应的影响等因素，导致部分地方优良品种逐渐杂化、群体数量急剧减少，甚至处于灭绝或濒临灭绝的状态，因此，畜禽遗传资源的保护迫在眉睫。畜禽遗传资源保护的方法主要有活体保护（即保种场、保护区）、生物冷冻保存技术（即冷冻配子、细胞、胚胎等）、基因文库技术、体细胞克隆技术及分子遗传标记等［1］。精液冷冻保存技术（Semen freezing）是利用液氮（-196 ℃）或干冰（-79 ℃）等作为冷源，将动物的精液通过特殊处理后，在超低温环境中进行长期保存的一种方法。该技术以其优势在濒危物种的资源保护工作中备受青睐，解决了人工授精受时间和空间限制的问题，为畜禽遗传资源保护提供了有利条件。精液冷冻保存技术在奶牛、猪、羊、马等家畜遗传资源保存中取得了进展，并逐渐应用到生产实践中，是家畜遗传资源长期保存的有效方法。本研究从精液冷冻技术的发展历程、细胞冷冻损伤机制、家畜精液的采集、精液品质检测、稀释液成分、精液稀释方法、冷冻及解冻方法等关键技术环节，对精液冷冻技术在家畜中的研究进展进行综述，以期为精液冷冻技术的应用发展提供参考。

1 精液冷冻技术的发展历程

精液冷冻技术研究已经受到国内外研究者的广泛关注。1776 年，Lazaro Spallanzani 发现，将人的精液埋藏在雪中一段时间，恢复温度后仍有少数精子可以存活［2］，这一发现为后来的精液冷冻技术打下了基础。1949 年，Polge 等［3］发现在牛精液冷冻保存时加入甘油对精子具有保护作用并且通过试验发现，在家禽精液稀释液中加入20%的甘油后放置在-80 ℃短暂冷冻保存，解冻后精液能够恢复活力。这一发现标志着精液冷冻技术的诞生。此后，许多研究者相继在牛、马、猪、羊等多种家畜中进行精液冷冻技术的研究，并取得了相应成果。这些研究包括冷冻稀释液的成分、冷冻保护剂种类及浓度、稀释方法、冷冻方法、降温速率及解冻方式等。随着该技术的发展，其在畜禽种质资源保护中发挥着越来越大的作用。

2 精液冷冻保存机理及损伤机制

精液冷冻技术是利用低温条件下，精子的新陈代谢减弱，一切生命活动缓慢到几乎完全停止的状态，从而达到长期保存精液的目的。同时，冷冻保存的精子，在合适条件下（温度、时间等）解冻复苏后，生命活动完全或部分恢复，其质量足以完成正常的人工授精过程，从而解决了人工受精过程中精液受时间、空间等限制的问题。在精液的冷冻过程中，精子会受到不同程度的化学损伤和物理损伤，从冷冻技术发展以来，对细胞冷冻损伤机制的探索没有停止。很多学者对细胞冷冻机制做了大量研究，并提出了多种假说。20 世纪50 年代科学家Lovelock 等提出电解质失衡假说，1951 年Kreyberg 提出血液循环障碍假说，1965 年Karrow 提出结构水假说，1970年Meryman 提出最小临界细胞容积假说，1972 年Mazur提出细胞冷冻损伤的两因素假说等［4］。其中，细胞冷冻损伤的两因素假说提出以后，得到大多数学者的认同。该假说认为，低温冷冻过程中造成细胞冷冻损伤，主要是由2 个独立因素引起的，即溶液浓度的改变和胞内冰晶的形成，从而使得精子受到不同程度的溶液损伤（化学损伤）和胞内冰损伤（物理机械损伤）［5］。

如图1 所示，在精液冷冻过程中，降温的速率对细胞损伤程度起决定性作用。当温度逐渐降低到溶液冰点时，精子外的溶液会形成冰晶（图1B），此时若降温速率过慢，胞外水分不断形成冰晶，导致细胞外液电解质浓度过高，胞外溶液渗透压增大，胞内水分不断通过细胞膜流向细胞外，使得精子因严重失水发生收缩；随着胞外冰晶持续不断形成，细胞外液长期处于高渗状态引起细胞持续收缩，造成精子蛋白质损伤及细胞膜的不稳定，从而产生“溶液损伤”，即化学损伤（图1C）。若此时降温速度过快，会导致细胞内的水分来不及渗出就直接形成冰晶，胞内冰晶会破坏精子的超微结构，产生“胞内冰损伤”，即物理机械损伤（图1D）。无论是快速降温引起的胞内冰晶损伤，还是慢速降温引起的溶液损伤，都能导致精子死亡。因此，为了减少低温冷冻过程对精子的损伤，保证精子的存活率，需要在溶液损伤和胞内冰损伤之间找到平衡点，使得降温速率低至能够防止精子形成胞内冰晶损伤，高到可以将溶液损伤降到最低，即最佳冷冻降温速率。当降温速率低于最佳降温速率时会导致精子遭受溶液损伤，而降温速率高于最佳降温速率时细胞内形成胞内冰晶，导致精子遭受物理机械损伤［6］。

图1 精子冷冻过程中溶液损伤和胞内冰晶损伤形成过程

3 家畜精液冷冻的关键技术

3.1 家畜精液的采集

精液的采集是制作家畜冷冻精液的重要步骤，采集精液的质量对制作冷冻精液成功与否具有决定性作用。常用的采精方法主要有手握法、按摩法、假阴道法、电刺激法。不同家畜适宜的精液采集方式也不同。如猪精液的采集，手握法较为常见。此外，采集精液时需严格按照技术流程进行规范操作；采集精液前需要做好卫生清洁工作；采精时一般仅保留中段精液，以确保所采集的精液能满足冷冻保存和受精的质量要求。

精液冷冻前需要进行精液质量鉴定，主要从精液的外观（一般包括精液颜色、气味、采精量、质地等）、显微镜观察（精子的活率、密度和形态）等方面进行检查。对于家畜来说，合格的精液一般为乳白色或浅灰色，略带腥味，质地均匀无水乳分离现象。不同物种射精量也不相同，一般情况公猪的一次射精量为200～400 mL，奶牛为5～10 mL，水牛为3～6 mL，绵羊为0.8～1.2 mL。合格的猪原精液外观色泽正常，为乳白色，有一点腥味但无臭味，精液中没有脓性分泌物及其他脏污，检测精子密度≥2 亿∕mL，活率≥90%，活力≥80%，畸形率≤10%［7］。

3.2 精液冷冻技术

3.2.1 精液稀释液的成分 精液冷冻稀释液主要包括冷冻保护剂、缓冲液、添加剂、抗氧化剂及抗生素等［8-10］，如表1 所示。在精液冷冻过程中，由于温度降低，精子内外会形成不同程度的冰晶并且导致细胞渗透压改变，从而造成精子产生不同程度的损伤［11］，为了减轻细胞的损伤程度，需要在精液稀释液里加入冷冻保护剂。冷冻保护剂可以改变细胞的渗透压，防止细胞长时间的持续严重脱水，减轻细胞收缩程度。此外，冷冻保存液可以有效缓解胞内冰晶的形成，从而降低精子在冷冻过程中受到损伤的程度［12］。冷冻保护剂根据化学结构可分为醇类、酰胺类、糖类、蛋白质、无机盐等，根据作用机制可分为渗透性冷冻保护剂（丙三醇、乙二醇、丙二醇、甲醇等）和非渗透性冷冻保护剂（糖类、卵黄等）。

表1 畜禽冷冻精液稀释液种类、作用和常用物质

甘油是应用较广泛的渗透性冷冻保护剂，其可以从细胞外渗透到细胞内，并且与膜脂的极性头基团形成氢键，阻断水分子自由渗透，降低细胞膜内外溶液浓度差，减少渗透性损伤。此外，甘油黏度增加可以防止溶质共生结晶，从而改变保护剂的机械性能，减少机械损害［13-15］。研究表明，高浓度的甘油会对精子产生毒害作用，从而影响冷冻精子的受胎率［16］。为了减少甘油对精子的毒害作用，寻找最佳的使用浓度，许多学者对不同物种精子稀释液中甘油适宜浓度进行了研究。刘晋津等［17］研究表明，在猪精液抗冻保护剂中加入4%的甘油，冷冻-解冻后精子活力最佳。宋国欣等［18］的研究表明，在绒山羊精液抗冻保护剂中联合使用海藻糖和甘油具有较好的冷冻保存效果，当甘油浓度为1%时，精子冷冻保存效果最佳。张鹏等［19］研究发现，在牛冷冻精液稀释液中添加4%的甘油，精子冷冻效果最好。郝冠英等［20］研究表明，在绵羊精液冷冻稀释液中使用甘油与二甲基乙酰胺（DMA）协同作用可以提高精子冷冻保存的效果，并且甘油浓度为3%时效果最佳。

糖类是一种很好的非渗透性冷冻保护剂，在稀释液中同时加入糖类和甘油，可以很好地降低精子受损伤程度，从而达到更好的冷冻保护效果。在实际研究及应用中，通常使用葡萄糖、乳糖、果糖、甘露醇、海藻糖等糖类作为冷冻保护剂。张树山等［21］研究表明，在猪精液冷冻稀释液中添加海藻糖的冷冻保护效果显著优于蔗糖、乳糖。郭志林等［22］研究发现，在稀释液中加入果糖可以提高乌骨羊精液解冻后精子的运动和存活能力、质膜与顶体的完整性。刘维平等［23］研究了海藻糖对牛精液冷冻保存效果的影响，发现添加海藻糖能提高牛精液冷冻保存后精子存活率，添加0.06 mg∕mL 海藻糖时精子顶体完整率最高。

卵黄在精液冷冻过程中也具有很好的冷冻保护作用，卵黄中的低密度脂蛋白会依附到精子的细胞膜上，形成一种凝胶化状态的保护膜，保护精子质膜的完整性，避免其受到损伤，从而达到保护精子的作用，不同物种中卵黄的添加量也各不相同。研究表明，在山羊精液稀释液中加入2.5%的卵黄，精子解冻后，用于人工授精效果较好［24］。在牛的精液稀释液中添加8%的椰子油与20%的卵黄，可以提高解冻后精子活力［25］。在猪冷冻精液稀释液中，研究不同浓度卵黄对冷冻后精子质量的影响发现，精液冷冻稀释液中卵黄的浓度以20%为宜［26］。张桐炜等［27］对辽宁绒山羊冷冻稀释液的配方研究发现，辽宁绒山羊最适细管冷冻基础稀释液E（100 mL）配方为Tris 3.44 g、柠檬酸1.83 g、果糖1.26 g、15%的卵黄、5%的甘油。

此外，精液稀释液的成分还包括添加剂、抗氧化剂、缓冲液等。研究表明，在猪精液冷冻稀释液中添加咖啡因、乙酮可可碱、细胞因子、氨基多糖、抗生素等物质，不仅可以提高精子活力，还可以延缓精子衰老［28］。在精液冷冻过程中，由于受低温环境的影响，精子会产生大量的活性氧（ROS），过量的活性氧会对精子顶体、质膜、蛋白质、线粒体等结构造成损伤，从而影响精子冷冻保存后的功能及活性［29］。为了减少ROS 对精子的损伤，可以在精子稀释液中加入抗氧化剂，如白藜芦醇、虾青素和黄芪多糖等。Zhu 等［30］对猪精液冷冻保存中白藜芦醇是否通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）保护猪精子免受ROS 胁迫进行研究，结果表明，添加50 μmol∕L 白藜芦醇可显著提高猪精液解冻后精子的活力、质膜及顶体的完整性、线粒体活性、谷胱甘肽（GSH）水平及AMPK 的磷酸化水平等。Guo 等［31］研究表明，在猪精液冷冻稀释液中添加虾青素（AST）可以抑制精子质膜过氧化，调节质膜脂肪酸的组成，能够有效提高解冻后精子的质膜及顶体的完整性、精子活力等。Weng 等［32］研究表明，在猪精液稀释液中添加黄芪多糖可以降低ROS 的浓度，提高精子的抗氧化能力，避免精子受氧化应激反应的影响。

3.2.2 精液的稀释方法 常用的精液稀释法有一次稀释法和二次稀释法。一次稀释法是将精液与含有甘油的稀释液按比例一次性稀释后直接进行冷冻；二次稀释法是将精液与稀释液Ⅰ（不含甘油）等体积混匀（降温前），随后缓慢降温至5 ℃后与等体积的稀释液Ⅱ（含有甘油）混合，置于5 ℃环境平衡5 min，使溶液中的甘油充分混匀。二次稀释法可有效减少甘油对精液中精子的毒害作用。

根据精液分装保存方式的不同，可分为安瓿法、颗粒法、细管法和扁平塑料袋法。颗粒法一般使用一次稀释法制作，细管法和扁平塑料袋法常选择二次稀释法。在实际生产中，使用频率较高的是细管冻精法，其具有冷却迅速、密闭无菌、不易污染、操作方便等特点，细管保存法常用的规格有0.25、0.50、5.00 mL。Bwanga 等［33］研究发现，0.25 mL 细管冻后精子活率明显高于5.00 mL 细管。薛琦［34］通过分析细管类型对猪精液冷冻保存解冻后精子活力的影响发现，-80 ℃条件下，0.25、0.50 mL 细管冷冻效果无明显的差异，而-196 ℃条件下，0.50 mL 细管冷冻效果明显优于0.25 mL 细管。

3.2.3 精液的冷冻 精液冷冻方法主要采用的是程序冷冻法和液氮熏蒸法。程序冷冻法主要是通过程序化控制液氮喷入冷冻仪的量来控制降温的速率。程序冷冻法可以实时监控温度的变化，通过控制温度下降的速率，减少降温速率对精子形成的损伤，但程序冷冻法对仪器设备的要求较高。液氮熏蒸法一般采用泡沫箱或自制的冷冻仪装液氮，过程简单、快捷、易操作，对仪器设备的要求较低，但无法控制冷冻过程中温度下降的速率。吴衍等［35］通过研究对比犬精液的冷冻方法发现，使用程序冷冻法的冷冻效果显著优于液氮熏蒸法。

3.3 冷冻精液的解冻

冷冻精液的解冻方式一般有干解法和湿解法。干解法是将冷冻的精液放置于设定温度的水浴锅中解冻，随后与预热的解冻液按一定的比例混匀。细管法冻存的精液一般使用干解法解冻。湿解法是将冻存的精子直接放到预热的解冻液中解冻，颗粒法冻存的精液一般使用湿解法解冻。

冷冻精液的解冻温度、时间对解冻后精子的存活率、顶体及质膜的完整性等具有重要影响。精子在解冻时存在1 个温度危险区，即-25～-5 ℃，为避免精液解冻过程对精子造成损伤，需快速越过温度危险区，减少在温度危险区停留的时间［36］。冷冻精液解冻时，可以根据不同的解冻温度设置不同的时间来提高解冻后精子的活力，延长精子存活时间。郝爱玲等［37］通过使用不同解冻方法解冻猪冷冻精液后发现，50 ℃快速解冻16 s 后，置于30 ℃静置40 s的解冻方式较38 ℃慢速解冻30 s 的精子活力好，顶体完整率高。郑筱峰等［36］通过对姜曲海猪不同解冻方法的冷冻效果研究发现，在解冻精液时，直接将冷冻精液从液氮中转移到37 ℃水浴的解冻效果（精子质量）较置于室温一定时间后转移至37 ℃水浴的解冻效果好。凌培凤［38］研究发现，猪冷冻精液的较佳解冻温度及时间分别为37℃解冻30 s、65 ℃解冻5 s。王凤改等［39］通过研究肉牛解冻温度对精子活力的影响发现，39.5 ℃解冻30 s 精子活力最好。马玉婷等［40］在牛精子活力的影响试验中发现，牛冷冻精液解冻的较佳解冻温度和时间分别为90 ℃解冻3～4 s、80 ℃解冻4～5 s、70 ℃解冻4～6 s 及80 ℃解冻8～9 s。

4 展望

通过不断的研究与探索，精液冷冻保存技术在国内外都得到了迅速发展。虽然精液冷冻技术正在逐步应用于畜禽的精液保存中，但是仍存在很多问题需要解决，如降低精子在冷冻过程中受损伤的程度、提高精液解冻后精子的活力、顶体及质膜的完整性等。影响精液冷冻质量的因素很多，如冷冻稀释液的成分、冷冻保存液的选择、冷冻方法、冷冻下降速率、解冻方式、解冻温度及时间等，这些因素与精液冷冻保存成功与否有密切联系。此外，精液冷冻的相关机理、变化规律等尚不清晰，冷冻过程中发生的分子机制及机理还有待进一步研究。

精液冷冻保存技术对于畜禽遗传资源的保存及利用具有重要意义，通过对冷冻保存关键技术的研究，探索适合的冷冻保存液，优化试剂成分和物质浓度，寻找最佳降温速率，使用恰当的冷冻-解冻方法及程序等，减少精子在冷冻保存中受到的化学和物理损伤，进一步提高精子存活率及解冻后的受精能力，将有助于畜禽精液冷冻技术的建立、完善和标准化，从而加快地方优良种质资源的保存与利用。