维甲酸结合蛋白CRABPs在肿瘤中的作用研究进展

林国粹 张颖 张庆余

卵巢癌是妇科恶性肿瘤中的致死率最高者,其早期症状和体征难以检测,缺乏有效的诊断标志物,导致大多数患者在首次诊断时已属晚期。细胞内类维甲酸结合蛋白1(CRABP1)具有潜力激活类维甲酸信号,可能作为一种潜在的肿瘤抑制因子,与浆液性和透明细胞卵巢腺癌的不良预后密切相关。然而,CRABP2在多种肿瘤中的表达异常,其既可能促进肿瘤的发展,也可能抑制肿瘤的发展,CRABP2的致瘤机制相当复杂,相关研究仍处于初级阶段。我们在本综述中总结了CRABPs在肿瘤中的最新研究进展,探讨CRABPs在各类肿瘤中的功能以及作用机制,以期为肿瘤诊治提供新的生物标志物。

1 CRABPs概况

CRABPs家族成员包括CRABP1和CRABP2均是小分子(<15 kDa)蛋白质,含有8个反向β-折叠组成的β桶形结构蛋白质。CRABPs的三维结构中其羧基头与口袋底部的2个精氨酸残基和1个酪氨酸残基相互作用。它们的序列同源性较低,折叠的相似性很高,是一种重复性很强的序列。在它们的序列中,同源性很低;而在它们的折叠中,相似性很高。它们的结构由一个螺旋-旋转-螺旋基序和2个接近正交的五链β-折叠组成。它们共享1个高度保守的三维结构,在一个反平行的β-桶中结合特定的疏水配体,该β-桶由2个正交的五链β-薄片构成。在holo-CRABPs的三维结构中,维甲酸被埋在结合口袋中,其羧基头基与口袋底部的2个精氨酸残基和1个酪氨酸残基相互作用。β-紫罗兰酮环扭曲成顺式相对于异戊二烯尾部的结构,作为口袋的入口,这样只有一个边可以接近溶剂,维甲酸被埋在结合口袋中,表明可能需要显著的构象变化以使RA从结合口袋中释放出来。人类CRABP1和2之间显示了74%的序列一致性,而且在物种之间也极为保守,例如大鼠、小鼠和牛的CRABP1都是相同的。 CRABPs 在胚胎中广泛表达,但它们通常不会共存于同一细胞中。这些差异表达谱,以及这两种同型的高水平的物种间保护,表明尽管它们的 RA 结合亲和力相似,但两种 CRABP 在 RA 生物学中具有不同的功能[1]。

CRABP1全名细胞维甲酸结合蛋白1,别名CRABP,CRABP1,CRABPⅠ,RBP5,它位于15号染色体。CRABP1编码维生素A家族成员的特异性结合蛋白,在介导RA对细胞分化和增殖过程中起着重要作用。CRABP1是蛋白质的脂肪酸结合家族的成员,它主要定位在细胞质中,并可以高亲和力结合RA,CRABP1可以调节催化RA代谢转化的酶的活性。对CRABP1参与人类癌症病理的了解甚少,CRABP1可以调节催化维甲酸代谢转化的酶的活性。成人中,CRABP1几乎无所不在表达。

CRABP2全名细胞维甲酸结合蛋白2,别名CRABPⅡ,RBP6,它基因位于1号染色体。CRABP2仅在皮肤、子宫和卵巢和脉络丛中表达。CRAPB2是视黄酸结合蛋白家族和脂钙蛋白/胞质脂肪酸结合蛋白家族的成员,是一种小的细胞溶质蛋白,含有138个氨基酸残基,但CRABP2与视黄酸的结合力远不如CRABP1。该蛋白是一种从细胞质到核的穿梭蛋白,在与视黄酸结合后大量发生核定位,增强核受体的转录活性,核受体与它共享一个共同的配体,即视黄酸受体 (RAR),它通过将视黄酸输送到该受体来发挥作用。它以依赖于配体的方式与 RAR 相互作用;在视黄酸的存在下,CRABP2-RAR 复合物是一种短命的中间体。RAR 转录活性的增强直接源于 CRABP2 将视黄酸引导至受体的能力。可促进RA与其同源受体复合物结合并转移至细胞核,增强核受体(Retinoic acid receptor,RAR)的转录活性[2]。

2 CRABPs在癌症中的表达

2.1 肺癌 肺癌导致的死亡人数占全球癌症相关死亡人数的1/4以上,近60%的肺癌患者在首诊断为晚期,肺癌最常见的类型是非小细胞肺癌(占87%)。黄海华等[3]发现CRABP2在95-D肺癌细胞中较高表达,干扰CRABP2的表达明显降低全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对95-D细胞的抑制作用,CRABP2高表达能够增强95-D细胞对ATRA的敏感性。此外,干扰 CRABP2后G1期细胞比例显著增加,而S期细胞减少,提示CRABP2除了可以介导 ATRA的效应之外,可能还参与细胞增殖的调控。CRABP2调节p38、ERK1/2和JUN等通路可以调控肺部细胞分化与增殖。活化的NF-κB也可以促进肿瘤生长,干扰CRABP2后,95-D细胞中NF-kBp65的总蛋白表达不受影响,但其磷酸化水平明显降低, SAPK/JNK和c-JUN的表达及磷酸化水平也有所降低。表明CRABP2的高表达也可以通过激活NF-kBp65和SAPK/JNK信号通路促进癌细胞的增殖。Wu等[4]发现CRABP2在转移增强的肺癌细胞中表达上调,CRABP2高水平与肺癌患者的晚期、总体生存率差和复发相关。CRABP2通过HUR(类胚胎致死性视觉基因1)和整合素β1/FAK/ERK信号促进迁移、侵袭和失巢抵抗。此外CRABP2可能是一种潜在的肺癌预后生物标志物,也可能成为抑制转移、增强吉西他滨和伊立替康对转移性肺癌细胞抑制作用的治疗靶点[4]。杜鹏研究指出血清中CRABP2的表达量检测可作为早期原发性支气管肺癌的潜在标志[5]。Kim等[6]发现血浆CRABP2水平随着TNM分期的增加而增加,血浆CRABP2高水平与非小细胞肺癌患者的不良预后相关,血浆CRABP2水平可能是非小细胞肺癌的一种新的诊断和预后标志物。

2.2 乳腺癌 乳腺癌是女性中最常见的癌症,三阴性乳腺癌指雌激素受体阴性、孕激素受体阴性和人表皮生长因子受体2阴性,占浸润性乳腺癌的10%～20%。Liu等[7]指出与正常乳腺组织相比,CRABP1在雌激素受体阳性乳腺肿瘤中的表达显著下调,在三阴性乳腺癌中表达不变。CRABP1高水平的患者预后差、Ki67免疫反应性高和肿瘤分级高。CRABP1通过滞留RA在细胞质中而减弱RA诱导的细胞生长停滞,抑制了RA在乳腺癌细胞中的信号传导。CRABP1还影响RA生物合成,运输和代谢的基因的表达,影响乳腺癌细胞对RA信号的响应[7]。陆进等[8]指出CRABP2在乳腺癌组织与细胞中高表达,且与乳腺癌患者生存预后不良相关。刘倩等[9]指出在乳腺浸润性导管癌中,表皮型脂肪酸结合蛋白(E-FABP)在肿瘤中的阳性表达率较CRABP2高, 伴有癌转移、TNM分期晚的肿瘤阳性率更高。肿瘤细胞中CRABP2/E-FABP 的比例决定着细胞的增殖和对RA 的敏感性,调节肿瘤细胞中CRABP2/E-FABP的比例有望成为乳腺癌个性化靶向治疗研究的新方向,为临床乳腺癌的治疗及基因靶向药物的研制提供重要依据[9]。Ju等[10]指出CRABP2 在乳腺浸润性导管癌和良性乳腺纤维瘤中度或强表达。4-氨基-2-三氟甲基-苯基视黄酸酯可能通过上调 CRABP2 来抑制增殖,并通过下调乳腺癌细胞中的 FABP5 来抑制侵袭和迁移。这有助于在乳腺癌中使用分化疗法[10]。

2.3 肝癌 肝细胞癌是发生在肝脏中的最恶性肿瘤之一,大多数肝细胞癌患者发现时已是晚期。 Chen等[11]研究指出随着肿瘤分期的发展,肝癌组织中CRABP2的表达水平升高,而在肝癌细胞系中CRABP2的表达水平也升高。shRNA敲低CRABP2导致体外抑制肿瘤增殖,迁移和侵袭,随后增加肿瘤凋亡相关蛋白的表达并降低ERK/VEGF途径相关蛋白的表达。肝细胞癌细胞中的CRABP2沉默也抑制肿瘤在小鼠体内发展。CRABP2可以用作新型诊断生物标志物,调控CRABP2在肝癌中的作用可能为肝癌治疗提供一个潜在的分子靶点[11]。

2.4 胰腺癌 胰腺癌是全世界的癌症死亡的主要原因之一。胰腺导管腺癌(PDAC)是最常见的胰腺癌类型。PDAC早期转移导致临床效果差。Tsai等[12]指出CRABP1的高表达与淋巴结转移和胰腺神经内分泌肿瘤分化差及等级高有关,它在间充质和神经内分泌肿瘤中的有促肿瘤发生和促转移活性,是临床中较有前景的生物标志物。Yu等[13]研究发现在胰腺导管腺癌细胞中缺失CRABP2并不影响癌细胞的增殖,而是减少了细胞的迁移和侵袭。基因表达芯片分析发现IL-8是在CRABP2缺失后显著下调的基因之一。CRABP2能够与HuR(类胚胎致死性异常视觉基因1)形成复合物,与IL-8信使RNA(mRNA)的3’UTR结合,增强IL-8 mRNA的稳定性。在CRABP2敲除细胞中异位表达CRABP2可以挽救IL-8、MMP-2/MMP-14的表达,恢复细胞迁移。CRABP2缺失会阻碍肿瘤转移到附近的淋巴结。CRABP2可能作为胰腺导管腺癌的一个新的治疗靶点。所有原发性胰腺导管腺癌和部分癌前病变均过度表达CRABP2,而正常的胰腺实质,导管上皮或慢性胰腺炎均不表达CRABP2。CRABP2通过调节IL-8/MMP-2/MMP-14途径增强癌细胞的迁移和侵袭[14]。

2.5 脑胶质瘤 胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,患者总体预后较差。近10余年发现,胶质瘤内的胶质瘤干细胞为放、化疗抵抗及肿瘤复发的根源。在众多的促分化药物中,维甲酸(RA)因促白血病干细胞的分化效应而在胶质瘤的研究中受到关注。曾令成等[15]表明CRABP2蛋白是细胞内维甲酸的结合转运蛋白,负责将维甲酸转运至维甲酸受体信号通路,有促细胞分化及凋亡功能。在脑胶质瘤中,CRABP2蛋白表达与胶质瘤恶性级别呈显著负相关,并可能介导了胶质瘤细胞对维甲酸的分化抵抗效应[15]。Liu等[16]指出CRABP2通过上调小型热激蛋白(CRYAB)和星形胶质细胞特异性中间丝蛋白(GFAP)来抵抗RA信号传导和动作,从而触发MG细胞的抗凋亡或细胞保护反应,这确定参与RA生物利用度调节的蛋白在亚细胞定位中预测RA反应的重要性。CRABP2是多形性胶质母细胞瘤(GBM)患者临床预后的重要决定因素,CRABP2在GBM中的作用机制是将RA阻断在细胞质中和激活抗凋亡药物途径,从而增强增殖并防止RA介导的细胞死亡和分化。降低CRABP2水平可以增强GBM患者的RA治疗指数[16]。

2.6 甲状腺癌 Celestino等[17]指出CRABP1在滤泡状甲状腺癌、甲状腺乳头状癌(及其变异体)以及所有 10 种甲状腺癌细胞系中的表达显着低于正常甲状腺和滤泡性甲状腺腺瘤。CRABP1的低表达可能是具有可疑恶性肿瘤的甲状腺肿瘤的有用诊断生物标志物[17]。Liu等[18]指出白藜芦醇能够消除CRABP2甲基化,从而提高甲状腺变性癌细胞THJ-11T和人髓母细胞瘤UW228-2细胞系对RA的敏感性。

2.7 其他肿瘤 膀胱癌(BC)是人类泌尿生殖道的第二大最常见恶性肿瘤,其特点是复发率高,但仍无诊断或监测人类BC的理想生物标志物。Jin等[19]研究发现与邻近的非肿瘤组织相比,BC组织中CRABP2和FABP5显着增加,具有较高的MASCOT评分和序列覆盖率。在Western印迹中,在所有32种膀胱肿瘤组织裂解物中CRABP2和FABP5均过表达。CRABP2和FABP5在BC组织中上调,并且CRABP2和FABP5可能作为BC的潜在新生物标记[19]。

食管鳞状细胞癌(ESCC)是在中国特别是河南省的主要食管癌(EC)型,预后较差,五年生存率有限。细胞视黄酸结合蛋白2(CRABP2)是视黄酸(RA)和脂钙蛋白/胞质脂肪酸结合蛋白家族的成员,在视黄醛信号通路中的肿瘤发生中起着完全相反的作用。Yang等[20]研究表明CRABP2在食管鳞状上皮肿瘤发生中起着抑癌作用,CRABP2在mRNA和蛋白水平在食管鳞状细胞癌组织中明显下调,并与 TNM分期,大小,肿瘤的浸润深度和细胞相关。CRABP2通过抑制细胞生长,诱导细胞凋亡和阻断细胞转移,在食管鳞状细胞癌变中起抑癌作用。CRABP2可能是诊断和预测食管鳞状细胞癌发展的有效分子[20]。

肾母细胞瘤或威尔姆斯瘤是儿童中最常见的肾癌,占该年龄组肾肿瘤的98%。其中有一个亚组患者易复发和死亡。视黄酸(RA)途径对细胞分化及其抗增殖,抗氧化和促凋亡活性具有影响,在化学预防和肿瘤治疗中起着重要作用。Gupta等[21]描述了CRABP2在肾母细胞瘤晚期癌症阶段(Ⅲ/Ⅳ期)表达增加,转移患者中RARA和CRABP2的表达增加,提示CRABP2在肾母细胞瘤中的细胞迁移和侵袭中的作用。在接受手术前化学疗法的患者和患有转移性疾病的患者中,RARA和CRABP2的免疫表达分别升高,对标记RARA和CRABP2进行的半定量和定量分析表明,它们具有潜在的生物标记作用,可用于肿瘤进展以及参与肾母细胞瘤的发生[22]。

宫颈癌(CC)是女性恶性肿瘤的世界第四大死因。宫颈癌肿瘤抑制基因的启动子甲基化谱通常被甲基化,从而促进癌症发生与发展。人乳头瘤病毒(HPV)癌蛋白(例如E6和E7)的存在会增加DNA甲基转移酶的活性并引起整体甲基化。Arellano-Ortiz等[23]指出宫颈癌组织CRABP1基因启动子甲基化水平增强,基因表达降低,提示CRABP1可能作为肿瘤抑制基因参与肿瘤进展,但具体机制尚不清楚。

2.8 卵巢癌 卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一,虽然发病率很低,但却是死亡率最高的妇科恶性肿瘤。卵巢癌早期缺乏症状和体征,导致诊断延迟,约75%患者被确诊为卵巢癌时已为晚期,卵巢癌的标准治疗包括手术和铂类化疗。目前,卵巢癌的5年生存率约为 47%,主要是由于复发和化疗耐药[24]。因此卵巢癌的早期诊断和治疗的新靶点是卵巢癌研究重点之一。根据组织来源,卵巢肿瘤可分为上皮细胞瘤,间质内分泌细胞瘤和生殖细胞瘤等不同类型。上皮性卵巢癌在组织病理学上分为浆液性,子宫内膜样,粘液性和透明细胞癌。这些亚型在其致癌机制、癌前病变、危险因素各方面有所不同。Persaud等[25]发现 CRABP1 在人卵巢癌细胞系 A2780 和小鼠胰腺导管癌细胞系 KPC 中表达丢失。CRABP1 在介导atRA非基因组活性中的生理作用,它的特异性配体可以在不涉及RARs的情况下诱导atRA的非基因组作用。CRABP1可以通过非典型激活 ERK1/2 来发挥肿瘤抑制因子的作用,诱导凋亡途径,抑制抗细胞凋亡,导致癌细胞死亡[26]。Toyama等[27]研究指出CRABP2在卵巢浆液性癌中特异性地高表达,并通过视黄酸使细胞对抗增殖信号转导敏感。CRABP2在卵巢透明细胞癌中几乎完全不存在,在子宫内膜异位症组织中低表达。CRABP2在透明细胞癌中表达低可能是由于它的分化特点,也可能与子宫内膜异位症来源的癌细胞有关。在透明细胞癌中,与CRABP2竞争的RA信号转导子FABP5的水平略有下调,但在其他亚型中通常是一致的,表明CRABP2不依赖于其他维甲酸信号通路而被解除调控。在星形胶质细胞瘤中也有类似的失调报道,其中CRABP2表达与不良预后相关[27]。

我们课题组利用生物信息学整合多个转录组数据对比分析,发现卵巢癌组织中视黄酸结合蛋白CRABP2基因表达水平比正常卵巢组织显著升高,临床样本分析发现CRABP2在卵巢癌中高表达,CRABP2不仅与肿瘤恶性程度正相关,而且与癌症的不良预后相关。CRABP2在卵巢癌的诊断中比目前使用的生物标记物CA125有更好的表现。我们提取了卵巢癌患者血清与正常健康志愿者血清中的外泌体,检测发现CRABP2存在于血清外泌体中并且癌症患者明显升高,表明使用常规的生化手段检测CRABP2就能够反应卵巢癌的病程进展,具有良好的应用前景。CRABP2不仅在卵巢癌中较高表达,而且与癌症预后不良有关。我们证实CRABP2是一种外分泌体蛋白,通过深入研究CRABP2在卵巢癌中的表达特点及其功能,CRABP2有望成为卵巢癌的诊断和预后标志物。

3 结论与未来展望

肿瘤是全球第二大死亡原因,生物标志物对于肿瘤早期发现和预后判断,及选择有效和适当的治疗手段有重要意义。ATRA(全反式维甲酸)是维生素A的主要活性成分,在生长发育、细胞分化增殖、生殖、神经元功能、视觉等生物过程中发挥着广泛的作用[28]。ATRA也用于某些治疗目的,通过与RARs(视黄酸受体)结合来调节基因表达,发挥其典型活性。在进入细胞核作用于RARs之前,ATRA在细胞质中被CRABP1和CRABP2结合。CRABP1阻断ATRA并调节其代谢,而CRABP2则将ATRA结合并传递给RARs,促进细胞分化及凋亡功能[25]。CRABP2近来报道与肿瘤表达有密切关系,且与病人预后相关。本文综述了关于CRABPs在肿瘤中的研究进展。

CRABP1对维甲酸的胞内活性没有影响,但能够激活类维甲酸信号。在某些人类上皮性肿瘤如结肠直肠癌、肝细胞癌、甲状腺癌和肾细胞癌中,CRABP1启动子高甲基化或CRABP1 mRNA水平下降。而食管鳞状细胞癌中CRABP1表达的降低与远处转移有关,并与浆液性和透明细胞卵巢腺癌的不良预后有关[29,30]。提示它可能是一种潜在的肿瘤抑制因子[31-34]。相反,CRABP1在子宫内膜样卵巢癌和高浸润性低分化子宫内膜腺癌中高表达[35,36]。

CRABP2在多种人类癌症中异常表达,包括乳腺癌,卵巢癌,前列腺癌,膀胱肿瘤,神经母细胞瘤,神经胶质瘤,头颈鳞癌,急性早幼粒细胞白血病和肾细胞癌等。CRABP2表达是在某些癌症类型上调或以其它形式下调。CRABP2在多种肿瘤中均有异常表达,它们之间存在着明显的异质性[3]。CRABP2在肿瘤发生中既起促进作用,也起抑制作用。见表1。

表1 CRABPs调控肿瘤进展的分子机制

我们应用综合分析的方法,寻找新的卵巢癌外泌体生物标志物,发现CRABP2不仅在卵巢癌中较高表达，而且与癌症预后不良有关。CRABP2有望成为卵巢癌的诊断和预后标志物。CRABPs是肿瘤中有潜力的分子,在肿瘤中高表达,可以作为分子标志物判断肿瘤进展快慢,但是它如何促进肿瘤进展具体机制不详。尽管CRABP2在多种肿瘤中均有异常表达,但对CRABP2的研究仍处于起步阶段。它们之间存在着明显的异质性。我们综述的CRABPs在肿瘤中的研究最新进展,深入研究CRABPs在各类肿瘤中的功能与作用机制,对于开发基于此靶点的肿瘤分子标志物与优化治疗手段有重要意义。