三种脊髓性肌萎缩症携带者筛查方法的性能评估

孙瑞红，蒋 祝，邵彬彬，谭建新*

1南京医科大学第一临床医学院医学检验学系，江苏 南京 210029；2南京医科大学附属妇产医院（南京市妇幼保健院）遗传医学中心，江苏 南京 210004

脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是一种常染色体隐性遗传病，是由于脊髓前角运动神经元变性导致的进行性近端肌肉萎缩和无力的一组疾病［1］。其发病率为1/6 000～1/10 000，人群携带率为1/40～1/50，在导致儿童死亡的常染色体遗传病中排名第2［2］。SMA致病基因为运动神经元存活基因1（survival motor neuron，SMN1），其纯合缺失是引起SMA 的主要原因［3］。SMN2 基因与SMN1 高度同源，作为修饰基因，影响疾病的严重程度［4］。通常情况下，SMA的发生95%～98%是由SMN1基因第7 号外显子的纯合缺失导致，2%～5%是由SMN1 基因点突变或部分缺失导致［5-6］。鉴于SMA人群携带率高，病情严重和治疗费用昂贵，美国医学遗传学会建议对所有育龄夫妇进行SMA携带者筛查［7］。

目前检测SMN基因拷贝数的方法较多，如多重连接探针依赖扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）［8］、实时定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）［9］、变性高效液相色谱法（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）［10］、基质辅助激光解析-电离飞行时间质谱法（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF）［11］、微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）［12］，以及下一代测序法（next generation sequencing，NGS）［8］。MLPA是检测SMN基因拷贝数的金标准，但其耗材贵且检测周期长，导致MLPA不适合大规模携带者筛查［13］。qPCR 操作简单，成本较低，是人群SMA 筛查最常使用的方法之一，但由于DNA 片段非特异性扩增，可能会出现假阳性结果，临床开展有一定的局限性［14］。

本研究对516 例样本同时使用MLPA、ddPCR、高分辨率熔解曲线（high-resolution melting，HRM）与多重竞争性PCR 联合毛细管电泳（PCR-based capillary electrophoresis，PCR/CE）技术对SMN 拷贝数进行检测并对这些方法的性能进行比较。

1 对象和方法

1.1 对象

收集2020 年3 月—2021 年10 月在南京市妇幼保健院使用qPCR方法进行SMA携带者筛查的患者共516 例，其中，男12 例，女504 例，平均年龄为（31.0±4.0）岁。所有受检者接受遗传咨询后自愿选择SMA筛查，并排除SMA家族史。每名受检者签署知情同意书，本研究经南京市妇幼保健院伦理委员会批准（编号：2020KY004）。

1.2 方法

抽取每名受检者外周血2 mL，使用自动核酸提取仪（厦门芮宝生医股份有限公司）提取基因组DNA，用下列方法对SMN拷贝数进行检测。

1.2.1 MLPA

MLPA 分析使用SALSA MLPA 试剂盒（P060-050R，MRC 公司，荷兰）按照标准操作流程进行检测。该试剂盒包含2个针对SMN1第7号和第8号外显子的序列特异性探针和1 个针对SMN2 第7 号和第8号外显子的探针。DNA变性后与MLPA探针混合物杂交过夜，然后进行探针连接和扩增。使用ABI 3500分析仪（赛默飞世尔科技公司，美国）对扩增产物进行检测，并使用Coffalyser.Net 软件（MRC公司，荷兰）分析数据。探针相对峰面积增加或减少30%分别表示重复或删除。

1.2.2 HRM

采用2 次多重探针PCR 反应检测SMN1 基因拷贝数。20 μL 反应体系包含100～200 ng 基因组DNA、1×PCR 缓冲液、0.5 μmol/L 引物、KlenTaq1 聚合酶和LCGreen 染料。PCR 反应在LightCycler 480（罗氏诊断公司，德国）上扩增：95 益5 min，95 益5 s，64 益降温至60 益30 s，共10 个循环，随后95 益10 s，60 益15 s，共25 个循环。扩增后产物95 益预热60 s，40 益孵育60 s收集熔解曲线进行分析。

1.2.3 PCR/CE检测

使用PCR/CE 试剂盒（厦门百欧迅公司）检测SMN1 基因拷贝数。该试剂盒包含SMN1 和SMN2基因第7 号和第8 号外显子的引物，β-globin 和βactin 作为内参。20 μL 反应体系包含15 μL PCR 混合物，3 μL 引物，0.16 μL DNA 聚合酶，和2 μL 基因组DNA。使用热循环仪，条件如下：95 益初始孵化5 min，然后进行25 个扩增循环（95 益30 s，57 益30 s，72 益30 s），最后在72 益下延伸30 min。然后，将PCR 产物与Hi-Di Formamide（赛默飞世尔科技公司，美国）和GeneScan 500 LIZ Size Standard混合。变性后，混合物在ABI 3500 遗传分析仪（赛默飞世尔科技公司，美国）上分离。通常情况下，得到的电泳图包括6 个峰（β-globin、SMN1-EX7、SMN2-EX7、SMN1-EX8、SMN2-EX8和β-actin）。

1.2.4 ddPCR

使用ddPCR SMN1 拷贝数测定试剂盒（Bio-Rad Laboratories，美国）按照标准操作流程进行操作。18 μL 体系中含有2×ddPCR Supermix for Probes、20×ddPCR SMN1 Assay 和HaeⅢ，并加入4 μL DNA样品。然后，取20 μL 混合物与70 μL 的Bio-Rad Droplet Generation Oil for Probes 混合，在Bio-Rad QX200TMDroplet Generator 上生成液滴。液滴产生后进行终点PCR。PCR 的热循环条件如下：95 益下10 min；94 益下30 s，55 益下1 min，35 个循环；98 益下10 min。Quanta Soft Analysis Pro软件以核糖核酸酶P/MRP 亚单位p30（RPP30）为参考基因进行SMN1第7号外显子的液滴集群分类和拷贝数计算。

1.3 统计学方法

每种方法检出的SMN1 和SMN2 拷贝数录入Microsoft Office Excel 软件进行数据分析。灵敏度=真阳性样本/（真阳性样本+假阴性样本）×100%。特异度=真阴性样本/（真阴性样本+假阳性样本）×100%。本研究中2 分类结果采用灵敏度和特异度进行评价。3 分类/4 分类变量采用加权Kappa 系数进行一致性检验，加权Kappa 一致性检验分析采用SPSS 26.0 软件包进行。Kappa 值是介于0 到1 之间的一个比率，其中0表示完全不一致，1表示完全一致。

2 结果

为了系统地比较目前用于SMA携带者筛查的方法，同时用MLPA、ddPCR、HRM 和PCR/CE 检测516 份DNA 样本。以MLPA 结果为金标准，计算ddPCR、HRM 和PCR/CE 检测方法的灵敏度和特异度。

2.1 灵敏度和特异度

针对SMN1第7号外显子，MLPA结果显示，107个样本为杂合性缺失（SMN1第7号外显子单拷贝），409 个样本为正常（SMN1 第7 号外显子≥2 拷贝）。与MLPA 结果相比，ddPCR、HRM 分析和PCR/CE 检测SMN1 第7 号外显子的拷贝数与MLPA 分析结果一致，灵敏度和特异度均为100.0%（表1、2）。

表1 HRM分析SMN1第7号外显子拷贝数

表2 ddPCR和PCR/CE分析SMN1第7号外显子拷贝数

在这4种方法中，只有ddPCR不包含针对SMN1第8 号外显子的特定引物。针对SMN1 第8 号外显子，MLPA 结果显示，101 个样本被归类为杂合性缺失（SMN1 第8 号外显子单拷贝），415 个为正常（SMN1 第8 号外显子≥2 拷贝）。与MLPA 结果相比，HRM 检测单拷贝的SMN1 第8 号外显子的灵敏度和特异度分别为100.0%和99.5%。检测2拷贝的灵敏度和特异度分别为99.4%和100.0%，检测＞2拷贝的灵敏度和特异度分别为100.0%和100.0%（表3）。相比之下，PCR/CE 检测SMN1 第8 号外显子的结果与MLPA 的结果一致，其灵敏度和特异度均为100.0%。

表3 HRM分析SMN1第8号外显子拷贝数

此外，MLPA 和PCR/CE 分析可以同时检测SMN1和SMN2。针对SMN2第7号和第8号外显子，PCR/CE检测的结果与MLPA一致，灵敏度和特异度均为100.0%（表4、5）。

表4 PCR/CE分析SMN2第7号外显子拷贝数

表5 PCR/CE分析SMN2第8号外显子拷贝数

2.2 4种方法的比较

表6总结了4种方法的各种特点。其中，ddPCR只能检测SMN1第7号外显子，HRM含有针对SMN1第7 号外显子和第8 号外显子的探针，而MLPA 和PCR/CE 能够量化SMN1 第7 号和第8 号外显子、SMN2第7号和第8号外显子的拷贝数。此外，MLPA、ddPCR和PCR/CE可以准确地检测出多达4拷贝，而HRM 只能准确地分析出多达2 拷贝。每个样品的成本根据我们从国内供应商处获得的价格计算（1 美元=6.9人民币）。

表6 4种SMN1和SMN2基因检测方法的特点比较

3 讨论

本研究纳入了516个样本，以MLPA 为金标准，比较ddPCR、HRM 和PCR/CE 检测SMN1 第7 号、第8 号外显子拷贝数的特异度和灵敏度。在这3 种方法中，PCR/CE 似乎是最可靠的方法，它与MLPA 在检测SMN1 和SMN2 的拷贝数方面表现出很好的一致性。

SMN1 第7 号第8 号外显子纯合缺失约占SMA患者的95%［15］。然而，也有SMN1第8号外显子纯合缺失，但第7号外显子未见异常的报道。Gambardella等［16］报告了2 例无亲缘关系的患者，由于SMN1 第8 号外显子纯合缺失而具有SMAⅡ型和Ⅲ型的典型表型。此外，1 例10 月龄的SMAⅠ型男婴表现为双侧视神经萎缩，是由SMN1第8号外显子的孤立缺失引起［17］。在以前的研究中，约有5%的中国孕妇携带SMN1第8号外显子的杂合性缺失，但有完整的第7 号外显子［9］。因此，除了SMN1 第7 号外显子，在SMA 携带者筛查中包含SMN1第8号外显子也很重要。在本研究中，ddPCR不包含针对SMN1第8号外显子的特异性探针，这可能导致SMA携带者筛查中出现额外的残留风险。MLPA、HRM分析和PCR/CE在量化SMN1 第8 号外显子方面具有相对较高的特异度和灵敏度，因此是适合SMA 携带者筛查的方法。

SMN2 是SMN1 的同源基因，两者仅有5 个碱基不同［18-19］。第7 号外显子中的1 个C-T 核苷酸转换导致大约90%的SMN2 转录本跳过该外显子，导致快速降解而不能补偿SMN1的功能［20］。剩余10%的SMN2 转录本不足以弥补SMN1 基因功能缺失。尽管如此，SMN2 拷贝数的增加一般与较温和的SMA临床表现有关［21-22］。因此，在SMA 携带者筛查中分析SMN2 拷贝数有助于预测疾病的演变，并为遗传咨询提供依据。此外，据报道，因为SMN1 和SMN2的同时缺失会导致胚胎死亡，SMN2 在所有SMA 患者中都被保留［23-24］。因此，SMN2 可以通过与SMN1同时扩增作为参考基因。在本研究中，除了MLPA之外，只有PCR/CE 分析可以同时测定SMN1 和SMN2的拷贝数，并与MLPA的结果表现出很好的一致性。

本研究存在如下局限性。首先，没有0 拷贝SMN1 的样本，无法评估这些方法在分析0 拷贝SMN1时的特异度和灵敏度。其次，这4种方法都不能检测SMN1 基因的点突变，而这一突变约占SMA病例的5%，导致携带者筛查中存在不可避免的残留风险。最后，这些方法都会将一小部分携带者（约4%）错误地归类为非携带者，这些携带者在同一条染色体上有2个重复的SMN1拷贝，而在另一染色体上没有拷贝［2+0］。

综上所述，本研究通过比较ddPCR、HRM 及PCR/CE 3 种检测方法在SMA 携带者筛查中的优缺点，为临床开展携带者筛查项目的技术选择提供参考依据。