灯盏细辛联合依帕司他对糖尿病肾病大鼠肾皮质中CAT、SOD、MDA表达的影响

2023-10-29屈雅娟张敬芳孙旗王雄易文媛陈贲彭攀郭承熙

中医药信息 2023年10期

屈雅娟，张敬芳，孙旗，王雄，易文媛，陈贲，彭攀，郭承熙

（长沙医学院第一临床学院，湖南长沙 410219）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病发展形成的最常见的慢性微血管并发症之一，主要表现为24 h 尿微量白蛋白升高，也是导致终末期肾病最重要的病因［1］。糖尿病肾病发病机制复杂，氧化应激和糖代谢紊乱是导致DN病情发展的关键因素［2］。

中药具有多靶点、作用协同等优势，对DN治疗效果显著。灯盏细辛为菊科短葶飞蓬（Erigeron breviscapus（Vant.）Hand-Mazz）的干燥全草，具有益气化阴、活血化瘀的作用，可改善DN糖代谢紊乱、氧化应激以及尿蛋白排泄率等［3-5］。依帕司他主要通过降低醛糖还原酶活性降低血糖水平，进而延缓DN病情进展以及改肾脏损伤，但其治疗糖尿病肾病尚具有争议，对肾脏具体的保护机制也尚不明确［4］。目前临床上药物治疗DN时易受多种因素影响，且单一的用药方案临床治疗效果尚有待提高，而中西医结合治疗方案治疗糖尿病及其并发症，可发挥其各自的优势，降低西药毒副作用，延缓DN病情的发展［6］。本实验观察灯盏细辛联合依帕司他对糖尿病肾病大鼠肾皮质中过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malonaldehyde，MDA）表达的影响，深入探讨灯盏细辛联合依帕司他对氧化应激的调控作用。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级SD 大鼠，雄性，50 只，体质量180～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK（湘）2019-0004。饲养室环境温度22～26 ℃，湿度40%～70%，明暗交替各12 h，实验大鼠自由饮水、摄食。

1.2 试剂及药物

高脂高糖饲料（南京盛民科研动物养殖场）；链脲佐菌素（STZ）（北京白鲨易科技有限公司，批号：BS185）；灯盏细辛提取物（灯盏花素）（云南生物谷药业股份有限公司，批号：20210601）；依帕司他（南京海陵药业有限公司，批号：21080045）；大鼠尿微量白蛋白（24 h UmAlb）试剂盒（武汉贝茵莱生物科技有限公司批号：20211127）；过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）（南京建成生物工程研究所，批号：20211127、20210909、20210916）。

1.3 方法

SD 雄性大鼠40 只，适应性喂养高脂高糖饮食1 周后，随机分为模型组、依帕司他组、灯盏细辛组和联合组，于左下腹单次注射1% STZ 55 mg/kg，注射后3 d于尾静脉用血糖仪测空腹血糖值，若血糖值≥ 16.7 mmol/L，表示糖尿病模型建立完成。之后再给予高脂高糖饮食喂养2 周，同时收集24 h 尿液，24 h UmAlb 为30～300 mg/24 h之间表示DN大鼠模型建立。依帕司他组在造模成功后灌胃依帕司他（100 mg/kg），给药体积为10 mL/kg，给药浓度为10 g/L，1次/d。灯盏细辛组在造模成功后灌胃灯盏细辛（200 mg/kg），给药体积为10 mL/kg，给药浓度为20 g/L，1次/d。联合组在造模成功后灌胃同等剂量的依帕司他和灯盏细辛，1次/d。另选10只大鼠作为正常对照组，模型组和正常对照组给予5% CMCNa混悬液10 mL/kg灌胃，1次/d，连续6周。

1.4 观察指标以及评价标准

①记录造模前，造模后2、4、6 周末大鼠的体质量和空腹血糖。禁食不禁水12 h后，测定大鼠体质量，于大鼠尾静脉用采血针扎取血液，测空腹血糖水平。②在造模前、造模后2 周、治疗后4、6 周末收集大鼠24 h尿液，尿液样本离心后移取其上清液后，严格按照ELISA 试剂盒说明书方法测量每组大鼠的24 h UmAlb。③在治疗后6 周末，将大鼠处死，取肾组织进行称重，冷生理盐水按1∶9 的质量体积比进行量取，再用匀浆机对组织匀浆继续充分研碎，制成10%的肾组织匀浆，将获得的组织匀浆离心后移取上清液，采用钼酸铵法检测肾皮质中过氧化氢酶（CAT）活性，WST1法检测大鼠肾皮质中超氧化物歧化酶（SOD）活性，TBA法检测肾皮质中丙二醛（MDA）含量，严格按照试剂盒说明书操作。

1.5 统计学方法

计量资料采用SPSS 26.0 统计学软件分析，并用均数±标准差（±s）表示。多组间平均值的差异采用单因素方差法分析，组间的两两比较采用LSD 和SNK法分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间点体质量的变化情况比较

造模后，模型组大鼠体质量有明显的下降趋势，治疗后2、4、6 周末模型组大鼠体质量显著低于造模前（P＜0.01）；在治疗后4 周末，各给药组体质量均显著高于模型组（P＜0.05，P＜0.01），而联合组大鼠体质量均高于依帕司他组和灯盏细辛组（P＜0.05，P＜0.01）；治疗后6 周末，各给药组体质量均显著高于模型组（P＜0.01），联合组大鼠体质量均高于依帕司他组和灯盏细辛组（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠不同时间点体质量的变化情况比较（±s，g）

注：与本组造模前比较，△△P＜0.01；与模型组同时间点比较，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；与依帕司他组同时间点比较，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01；与灯盏细辛组同时间点比较，□□P＜0.01。

治疗后6周末493.3±28.2 308.9±20.6△△389.0±23.3☆☆348.5±19.6☆☆412.1±10.2☆☆◇□□组别正常对照组模型组依帕司他组灯盏细辛组联合组n 10 10 10 10 10造模前357.2±23.1 367.1±17.4 358.0±26.3 361.8±30.1 383.2±25.0治疗后2周末403.9±18.8 340.5±13.7△△363.8±23.8 360.5±27.6 392.1±11.8治疗后4周末435.7±19.4 324.2±8.2△△373.9±20.7☆344.9±20.5☆401.4±14.5☆◇◇□□

2.2 各组大鼠不同时间点血糖的变化情况比较

单次注射STZ 后，模型组和各给药组的血糖值均＞16.7 mmol/L 且均显著高于空白组（P＜0.01），提示糖尿病模型造模成功。治疗后4、6 周末检测发现各给药组大鼠血糖呈现下降的趋势。治疗后4 周末，各给药组血糖水平显著低于模型组（P＜0.01），联合组血糖水平显著低于依帕司他帕司组和灯盏细辛组（P＜0.05）。治疗后6 周末，各给药组血糖水平显著低于模型组（P＜0.01），联合组大鼠血糖水平显著低于依帕司他组和灯盏细辛组（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠不同时间点血糖的变化情况比较（±s，mmol/L）

注：与正常对照组同时间点比较，△△P＜0.01；与模型组同时间点比较，☆☆P＜0.01；与依帕司他组同时间点比较，◇P＜0.05；与灯盏细辛组同时间点比较，□P＜0.05，□□P＜0.01。

治疗后6周末5.8±0.5 29.1±2.9 13.5±3.1☆☆19.0±3.0☆☆11.3±3.3☆☆◇□□组别正常对照组模型组依帕司他组灯盏细辛组联合组n 10 10 10 10 10造模后3 d 5.2±0.2 28.8±1.6△△29.2±3.2△△31.6±1.3△△27.6±3.1△△治疗后2周末5.2±1.1 27.3±3.3 17.9±4.1 21.4±2.5 17.0±1.1治疗后4周末5.6±1.3 29.2±3.4 14.5±3.1☆☆20.5±3.2☆☆13.6±3.4☆☆◇□

2.3 各组大鼠不同时间点24h UmAlb的变化情况比较

在糖尿病模型造模后2周，模型组和各给药组大鼠24 h UmAlb均显著高于空白组（P＜0.01），再结合模型组和各给药组大鼠血糖均＞16.7 mmol/L，提示糖尿病肾病模型造模成功。治疗后4周、6周末检测发现模型组大鼠的24 h UmAlb有上升的趋势，各给药组有下降的趋势。治疗后6周末，联合组大鼠24 h UmAlb显著低于模型组、依帕司他组和灯盏细辛组（P＜0.05，P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠不同时间点24 h UmAlb的变化情况比较（±s，mg）

注：与正常对照组同时间点比较，△△P＜0.01；与模型组同时间点比较，☆☆P＜0.01；与依帕司他组同时间点比较，◇P＜0.05；与灯盏细辛组同时间点比较，□P＜0.05。

治疗后6周末6.8±1.0 56.9±6.0 21.3±4.8 30.2±5.2 17.3±3.6☆☆◇□组别正常对照组模型组依帕司他组灯盏细辛组联合组n 10 10 10 10 10造模前5.8±0.9 5.7±0.9 5.6±1.0 5.7±0.9 5.4±0.8造模后2周末5.5±0.6 36.1±5.7△△35.4±4.2△△36.1±3.0△△25.5±2.5△△治疗后4周末5.4±1.1 51.3±6.2 27.1±3.3 33.4±2.7 17.9±3.1

2.4 各组大鼠CAT水平比较

CAT 是机体氧化应激的重要指标，其水平可反映机体对氧自由基清除的能力［7］。与正常对照组比较，模型组大鼠和各给药组肾组织CAT 水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，依帕司他组和联合组大鼠肾组织CAT 水平显著上升（P＜0.05，P＜0.01），灯盏细辛组虽然差异无统计学意义，但呈上升趋势。联合组大鼠肾组织CAT 水平比依帕司他组、灯盏细辛组显著上升（P＜0.01）。见表4。

表4 各组大鼠CAT水平比较（±s，U/mg）

注：与正常对照组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；与依帕司他组比较，◇◇P＜0.01；与灯盏细辛组比较，□□P＜0.01。

CAT 54.3±3.6 18.6±2.6△△25.7±7.2△△☆25.6±5.0△△40.2±9.3△△☆☆◇◇□□组别正常对照组模型组依帕司他组灯盏细辛组联合组n 10 10 10 10 10

2.5 各组大鼠SOD水平比较

SOD 是机体氧化应激的重要指标，其水平可反映机体对氧自由基清除的能力［8］。与正常对照组比较，模型组大鼠和各给药组肾组织SOD 水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，依帕司他组、灯盏细辛组和联合组大鼠肾组织SOD 水平显著上升（P＜0.01）；联合组大鼠肾组织SOD 水平比依帕司他组、灯盏细辛组显著上升（P＜0.05）。见表5。

表5 各组大鼠SOD水平比较（±s，U/mg）

注：与正常对照组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，☆☆P＜0.01；与依帕司他组比较，◇P＜0.05；与灯盏细辛组比较，□P＜0.05。

SOD 128.1±4.3 50.9±3.7△△87.7±5.7△△☆☆73.3±7.4△△☆☆109.1±7.5△△☆☆◇□组别正常对照组模型组依帕司他组灯盏细辛组联合组n 10 10 10 10 10

2.6 各组大鼠MDA水平比较

MDA 含量与肾组织损伤程度呈正相关，是典型的过氧化代谢产物［9］。与正常对照组比较，模型组大鼠和各给药组肾组织MDA 水平上升（P＜0.01）；与模型组比较，依帕司他组、灯盏细辛组和联合组大鼠肾组织MDA 水平显著下降（P＜0.01）；联合组大鼠肾组织MDA 水平比依帕司他组、灯盏细辛组显著下降（P＜0.05）。见表6。

表6 各组大鼠MDA水平比较（±s，nmol/mg）

注：与正常对照组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，☆☆P＜0.01；与依帕司他组比较，◇P＜0.05；与灯盏细辛组比较，□P＜0.05。

MDA 1.4±0.3 4.0±0.5△△3.0±0.3△△☆☆3.2±0.3△△☆☆2.0±0.7△△☆☆◇□组别正常对照组模型组依帕司他组灯盏细辛组联合组n 10 10 10 10 10

3 讨论

氧化应激是导致糖尿病肾病发病的主要作用机制，体内蓄积大量的氧化应激产物损伤了脏器［10-11］。氧化应激损伤指标包括CAT、SOD 和MDA，其中SOD可调节机体氧化与抗氧化的平衡，避免细胞发生损伤，其活性的下降是机体氧化应激的主要生物指标［8］；CAT 是机体防御系统的主要自由基清除剂，其主要能够清除过氧化氢，达到保护细胞的作用［7］；MDA是临床上常用来反映机体氧化应激程度的标志物，其含量的升高会导细胞损伤加重［9］。本研究结果表明，模型组大鼠肾组织CAT和SOD活性显著下降，MDA 含量显著上升，提示模型组大鼠肾功能出现了明显损伤。给予灯盏细辛联合依帕司他治疗后，肾组织SOD、CAT活性升高，MDA 含量下降，且作用效果显著优于单一给药治疗，表明灯盏细辛联合依帕司他可上调CAT、SOD水平，降低MDA 含量，提示其可减轻糖尿病肾病大鼠机体的氧化应激，发挥抗氧化应激作用。

氧化应激与高血糖、肾功能均紧密相连［12］，有研究表明CAT 活性表达与血糖水平密切相关［13-14］，且高血糖是糖尿病肾病早期常见的并发症，尿液出现微量白蛋白是糖尿病早期可能出现的特征性症状，及时控制糖尿病肾病高血糖和微量白蛋白含量是延缓糖尿病肾病病情发展的最重要环节［12，15-16］。本研究表明，糖尿病模型造模成功后2 周，模型组和各给药组大鼠的血糖值均＞16.7 mmol/L 且24 h UmAlb 均大于30 mg，提示发生了糖尿病肾病。治疗过程中，联合组大鼠空腹血糖和24 h UmAlb 水平呈现显著下降趋势，体质量呈现显著上升趋势，且与正常大鼠的水平最接近。联合给药的降糖、减少尿蛋白的效果显著强于单一给药组。提示灯盏细辛联合依帕司他可发挥协同作用，降低大鼠的空腹血糖和提高肾功能，对糖尿病肾病有一定的干预作用。