脱脂南极磷虾蛋白质提取条件优化

耿 乐,王洪斌,刘志东,张俊杰,段 蕊,林 娜,倪 玲,迟 海

(1江苏海洋大学食品科学与工程学院,江苏 连云港 222005;2中国水产科学研究院东海水产研究所,上海 200090)

南极磷虾(EuphausiasuperbaDana)属于节肢动物门、甲壳纲、磷虾目,是一种小型甲壳动物,其生物资源量预计在10亿t左右,不仅为南大洋食物网中的关键物种而且具备极高的商业价值[1]。南极磷虾含有丰富的蛋白质,蛋白质湿基含量达11.9%～15.4%[2],干基含量约为70%[3]。其蛋白质含有世界卫生组织/粮农组织/联合国大学(WHO/FAO/UNU)要求的全部必需氨基酸,所有必需氨基酸含量均高于WHO/FAO/UNU对成人(婴儿)的要求,有潜力成为人类未来可开发的优质蛋白质资源。

目前针对南极磷虾蛋白质提取已有较多研究,高飞等[4]优化了南极磷虾蛋白质提取工艺,得到冷冻南极磷虾蛋白质的提取条件。廖鄂[5]采用ISP技术提取南极磷虾蛋白质,通过改进提取条件使蛋白质提取率提升至63%。王灵昭[6]系统研究了碱溶酸沉法提取南极磷虾蛋白质工艺,并研究了脱氟技术。Chen等[7]采用不同的pH处理,通过溶解/沉淀从整个南极磷虾中回收蛋白质和不溶物。蛋白质提取率为45% ～ 50%(干基)。以上研究主要是以冷冻南极磷虾等为原料。Wang等[8]研究了以脱脂南极磷虾粉为原料提取蛋白质,经过二次提取得到的分离蛋白质最高得率为28.66%,但未对提取条件进行优化,提取时间较长。

因此,针对脱脂南极磷虾粉的高值化利用研究亟待更加深入地开展。脱脂南极磷虾粉主要为提取磷虾油后的副产物,目前主要作为饲料原料,价格低廉且蛋白质含量高[9]。探索一种高附加值的方法来利用这种富含蛋白质的材料已引起研究人员和工业界的广泛关注[10]。

本研究以脱脂南极磷虾粉为原料,以蛋白质得率为指标在单因素试验基础上对提取时间、提取温度、NaOH百分比浓度、料液比进行分析,并通过响应面法优化得出提取的最佳参数,以期为脱脂南极磷虾粉高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂南极磷虾粉(蛋白质含量不低于75%)于2021年6月购自中水集团远洋股份有限公司。氢氧化钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);盐酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);试验用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

90-2型定时恒温磁力搅拌器(上海沪西分析仪器厂有限公司);SHJ-4CD数显恒温磁力搅拌水浴锅(常州市金坛友联仪器研究所);6200型立式冷冻离心机(日本久保田株式会社);PHS-3C型pH计(上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂);AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);FreeZone真空冷冻干燥机(美国LABCONCO公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 DAKP提取工艺流程

提取工艺流程参考高飞等方法[4]:脱脂南极磷虾粉→碱溶→恒温浸提→回收上清→调节pH→离心→回收沉淀→调节pH至7.0→真空冷冻干燥→DAKP。

1.3.2 单因素试验

参考Wang等[8]、任宪君等[11]、郭静等[12]方法进行单因素试验。以DAKP得率为指标,分别研究碱溶阶段NaOH溶液百分比浓度(1%、1.5%、2%、2.5%、3%),提取温度(60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃),料液比(w/V)(1∶10、1∶12.5、1∶15、1∶17.5、1∶20),提取时间(30 min、45 min、60 min、75 min、90 min)对DAKP得率的影响,确定较优的提取条件并进一步优化。

蛋白质得率按下式计算:

XDAKP=100%×m/M

(1)

式中:XDAKP表示得率;m表示蛋白质质量(g);M表示脱脂南极磷虾粉质量(g)。

1.4 响应面优化试验

因素水平分析见表1。

表1 DAKP提取的因素水平表

基于单因素试验结果,选择提取温度、提取时间、NaOH百分比浓度3个影响较为显著的因素作为自变量,以蛋白质得率为因变量,采用Design-Expert 8.0.6软件的Box-Behnken 设计模块进行优化。设计3因素3水平一共17个试验点的响应面分析试验。其中12个为析因点,5个为零点。

2 结果与讨论

2.1 DAKP提取的单因素试验结果

2.1.1 提取温度DAKP得率的影响

蛋白质在不同温度下溶解度不同[13],参考任宪君等[11]、郭静等[12]的研究方法,选择提取温度为60 ℃～80 ℃进行试验。由图1可见,随着提取温度的增加,DAKP得率呈现出先增后减的趋势。在60 ℃～70 ℃时,蛋白质得率不断增加,当提取温度为70 ℃时,蛋白质得率达到最大,提取温度超过70 ℃,蛋白质得率开始下降。可能是随着温度的升高,分子运动增强[14],蛋白质分子的构象发生变化,因此蛋白质能更好地从原料中析出。

图1 提取温度对DAKP得率的影响

但随着温度的进一步升高,可能会导致蛋白质热诱导变性或热诱导凝胶化[15],从而降低蛋白质的溶出,导致蛋白质得率下降,这与孟桥等[16]研究一致。综合考虑,确定最适提取温度选为70℃。

2.1.2 料液比对DAKP得率的影响

由图2可知,蛋白质得率随着料液比的增大呈现出先增后减的趋势,图2表明当料液比在1∶10～1∶15时,蛋白质得率持续增大,在1∶15时蛋白质得率最高;当料液比大于1∶15,蛋白质得率持续下降,在1∶20时达到最低。其原因可能是当料液比过低时,体系的黏度太大,虾粉分散不均匀,无法使得蛋白质完全溶出,从而导致得率不高[17]。

图2 料液比对DAKP得率的影响

料液比过高时,DAKP在体系中过于分散,溶液百分比浓度得到稀释,使得有效组分含量低,粒子之间无法充分接触,溶解难度增加,致使蛋白质得率降低。这与赵节昌[18]、Moncef等[19]的结论相似,他们发现料液比增加到一定值,蛋白质产率会增加,随着比例增大,产率下降。综合考虑,最适料液比为1∶15。

2.1.3 提取时间对DAKP得率的影响

由图3可知,随着提取时间的增加,蛋白质得率呈现先增后减趋势。

图3 提取时间对DAKP得率的影响

提取时间在30～60 min时,蛋白质得率逐渐增加,在60 min时,蛋白质得率达到最大。提取时间在60～90 min时,蛋白质得率逐渐降低。30 min时蛋白质得率低的原因可能是由于提取时间太短,物料没有充分混匀,蛋白质没有完全溶出,导致蛋白质得率低。60 min后蛋白质得率下降的原因可能是提取时间过长造成蛋白质在碱性条件下浸泡时间过长,空间结构被破坏[20],部分蛋白质发生变性凝聚反应[24],导致得率下降。所以,总体呈现出先增加后减少的趋势,这与周丽卿等[21]研究结果一致。综合考虑最适提取时间为60 min。

2.1.4 NaOH百分比浓度对DAKP得率的影响

由图4可知,DAKP的得率随着NaOH百分比浓度的增加呈现出先增后减的趋势。

图4 NaOH百分比浓度对DAKP得率的影响

当NaOH百分比浓度小于2%时,随着百分比浓度的增加,蛋白质得率不断增长,在百分比浓度达到2%时,蛋白质得率达到最大。当NaOH百分比浓度大于2%,蛋白质得率开始下降。原因可能是随着pH增加,碱性环境会改变蛋白质结构,使其疏松,组成氨基酸之间发生了更高的静电斥力,导致蛋白质在碱性介质中的溶解度更高[22,23-24],所以蛋白质得率呈现出上升趋势。碱溶时适当增加碱液百分比浓度会使蛋白质得率得到提升,但过高的pH不仅会使蛋白质分子间难以聚合,且过高碱百分比浓度会加快美拉德反应的进行从而使蛋白质得率下降[25],与王立等[26]研究结果一致。因此NaOH溶液最适百分比浓度选为2%。

2.2 响应面模型的建立及结果

2.2.1 响应面的建模及显著性检验

根据单因素试验结果,通过响应面法中的Box-Behnken试验设计对DAKP提取工艺进行优化。以A(提取温度℃)、B (NaOH百分比浓度%)、C(提取时间min)为自变量,以蛋白质得率作为因变量,进行3因素3水平Box-Behnken响应面优化试验,得到表2所示结果。

表2 响应面试验设计与结果

采用Design-Expert.8.0.6,得到DAKP得率对提取温度、NaOH百分比浓度,提取时间的二次多项回归模型:DAKP得率=31.94-1.19A+2.49B+0.70C+0.12 AB+0.050AC-0.30BC-5.2 A2-5.86B2-1.78C2。

为了验证模型的可信度,针对该回归模型及回归方程进行误差统计分析,对方差、可信度、多元相关系数进行计算,得到如表3所示结果。模型P<0.000 1说明模型极显著,代表选取的各个条件对DAKP得率影响极显著,失拟项P>0.05不显著,说明模型正确且稳定,可以用来预测DAKP提取工艺参数。F值表示的是单因素对DAKP得率的影响程度,F值越大,影响越显著[27]。

表3 回归模型的方差分析及显著性检验

由3个因素F值大小可以看出其对蛋白质得率的影响排序为B>A>C,且均为差异极显著(P<0.01),AB、AC、BC对蛋白质得率没有显著影响(P>0.05),A2、B2、C2对蛋白质得率极显著(P<0.01)。

表4 回归方程可信度分析

2.2.2 响应曲面分析

提取温度、NaOH百分比浓度、提取时间三因素交互作用对DAKP得率的影响如图5～10所示,三维响应面和二维等高线图是回归方程的图形表示。它们展示了两个被测变量之间的相互作用类型,以及每个变量的响应与试验水平之间的关系[28]。等高线的形状可以反映各个因素之间的交互是否显著,椭圆表示两因素之间的交互作用显著,圆形表示两因素之间的交互作用不显著,响应面越弯曲表明此因素对结果影响越大[29-30]。

图5 提取温度与NaOH百分比浓度影响DAKP得率的等高线图

图5等高线图呈现圆形,表明提取温度与NaOH百分比浓度之间交互作用不显著,与表3显著性分析结果一致(P>0.05)。

图6三维响应面图可知,随着提取温度的增加、NaOH百分比浓度的增大,DAKP得率都呈现出先增后减的趋势,在提取温度70℃左右,NaOH百分比浓度在2.0%～2.5%之间蛋白质得率最大。这与贺莹[31]研究的温度与pH的交互作用对蛋白质提取量的影响趋势一致。

图6 提取温度与NaOH百分比浓度影响DAKP得率的响应面图

图7等高线图为圆形,表示提取温度与提取时间之间交互作用不显著,与表3显著性分析结果一致(P>0.05)。图8可知随着提取温度、提取时间的增加,蛋白质得率先增大后减小。得率最大值出现在提取温度为70℃左右,提取时间在60～70 min。这与侯召华等[32]研究的温度与时间的交互作用对蛋白质提取率的影响变化趋势一致。

图7 提取温度与提取时间影响DAKP得率的等高线图

图8 提取温度与提取时间影响DAKP得率的响应面图

图9圆形等高线图表明,提取时间、NaOH百分比浓度之间的交互作用对响应值影响不显著,符合表3的显著性分析结果(P>0.05)。由图10三维响应面图可知,随着NaOH百分比浓度、提取时间的增加,蛋白质得率同样呈现出先增后减的趋势,蛋白质得率最大值出现在NaOH百分比浓度2.0%～2.5%。提取时间在60～70 min。在这两个因素交互作用下对得率的影响趋势与赵海霞等[33]研究的结果一致。

图9 NaOH百分比浓度与提取时间影响DAKP得率的等高线图

图10 NaOH百分比浓度与提取时间影响DAKP得率的响应面图

2.3 模型的优化与验证

通过Design-Expert 8.0.6软件对提取条件进行优化,结果为提取温度68.90 ℃,NaOH百分比浓度为2.21%,提取时间为65.29 min,此时DAKP理论得率为32.32%。为了验证回归方程预测结果的可靠性,需要在上述研究得到的最佳提取条件(提取温度68.90℃、NaOH百分比浓度为2.21%、提取时间为65.29 min)下试验进行验证[34]。考虑到实际操作的可行性,将提取条件调整为提取温度69℃,NaOH百分比浓度为2.2%,提取时间为65 min,重复试验3次,实际得率为31.93%±0.35%,与理论值32.32%的相对误差为1.19%±1.01%,表明该模型对最优工艺的预测是可行的。

2.4 讨论

本研究的实际得率为31.93%±0.35%,要高于Wang等[8]的得率(28.66%),且本研究的提取工艺更为便捷,提取时间从其100 min减少到65 min;也高于高飞等[4]研究的南极磷虾蛋白质得率(10.91%),有很大可能与两者之间所用原料及提取条件不同有关。从试验结果来看,提取时间、提取温度、NaOH百分比浓度对蛋白质得率有较大影响,由响应面图的趋势可知,影响大小依次为NaOH百分比浓度>提取温度>提取时间。因南极磷虾蛋白质提取优化报道较少,与同为水产研究的候召华等[32]的各影响力大小一致。本研究的优点在于以低附加值的脱脂南极磷虾粉为原料提取蛋白质,有利于提高其附加值,充分利用南极磷虾这一宝贵资源,且相较于其他同类研究,蛋白质得率高、易操作、耗时短,有利于进行规模化生产。但仍有改进之处,比如将一次提取改为二次提取,进一步提高得率,以及环境友好地处理产生的废液。

3 结论

以脱脂南极磷虾粉为原料,NaOH溶液作为碱溶溶液,通过单因素法与响应面优化试验得到了碱溶酸沉法提取DAKP的最优条件。考虑实际可操作性,确定最优提取条件为碱溶溶液NaOH百分比浓度为2.2%,提取温度为69℃,提取时间为65 min,料液比为1∶15,此条件下得到的DAKP得率为31.93%±0.35%,与理论值32.32%的相对误差为1.19%±1.01%,且操作便捷。相较于其他脱脂南极磷虾蛋白质提取方法,本研究提取所需时间更短,更有利于规模化生产。期望本研究能促进南极磷虾附加值相关研究,推动南极磷虾产业的可持续发展。