藏兽医药用植物与抗生素联用对致病性大肠杆菌抑菌活性的研究

杨丹娇，张 敏，吴建平，蓝 岚*，潘 瑶，刘怡雯，陈朝喜，叶忠明

（1.甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所，四川 康定 626000；2.西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041）

在川西北高原牧区，广大牧民和兽医人员结合藏兽医药用植物资源优势总结和验证了一些藏兽医验方和偏方，在防治畜禽细菌传染病等方面具有积极作用［1-2］。基于此，笔者将61种常用藏兽医药用植物水提物与临床常用的抗菌药物联用，研究其对藏猪源致病性大肠杆菌的体外抑菌活性，以期为创制绿色中藏兽药提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 藏兽医药用植物和菌株的来源 61 种藏兽医药用植物（包括26个科55个属）采自甘孜藏族自治州不同地区，由西南民族大学兽医药理学与毒理学实验室陈朝喜副教授鉴定，药物标本编号后保存于该实验室。药物敏感性试验使用的质控菌株ATCC25922也由该实验室保存。

1.2 抗菌药物、培养基和化学试剂 四环素（TET）、链霉素（STR）、氟苯尼考（FLR）、恩诺沙星（ENR）、氨苄西林（AMP）5 种抗菌药物购自上海源叶生物科技有限公司；胰蛋白胨大豆（TSB）肉汤、麦康凯琼脂购自北京奥博星生物技术有限公司，MH 肉汤、MH 琼脂购自青岛海博生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO）等主要化学试剂均为分析纯级别。

1.3 61 种藏兽医药用植物水提物的制备 采集61种藏兽医药用植物置于通风处自然风干，粉碎后过60 目药典筛，分别取一定重量的粉末按1∶10的比例加入灭菌水浸泡30 min后煎煮1 h，双层纱布过滤后将滤液浓缩、冷冻干燥，－20 ℃保存。临用前，准确称取冻干粉，用灭菌水或DMSO溶解后制成1 g/mL的母液，－4 ℃保存备用。

1.4 致病性大肠杆菌SCP-ExP-coli2017-4307株的分离与鉴定 大肠杆菌SCP-ExP-coli2017-4307 株分离自稻城县某藏猪原种场的腹泻粪便样本。首先利用麦康凯培养基和伊红美兰培养基交叉传代后初步鉴定，然后采用PCR 扩增16S rDNA 进行分子生物学鉴定，通过肠杆菌科细菌生化编码鉴定管（15e）进行生化鉴定，确定为大肠杆菌后将纯化菌株用30%甘油于低温下保存。

1.5 药物敏感性试验 参照文献［3］方法略作改动：在96孔板的第1～12列加入100 μL MH肉汤，然后在第1 列加入已配制好的水提物母液100 μL作倍比稀释，最后1列作为空白对照，每药两次重复。挑取生长良好的中等大小菌落于MH肉汤中恒温静置培养12～16 h，调整到0.5 麦氏浊度，菌液稀释后加入100 μL 菌液至96 孔板1～11 列。37℃恒温培养12～16h，观察并记录结果。采用同样方法测定ATCC25922 和SCP-ExP-coli2017-4307株对四环素、链霉素、氟苯尼考、恩诺沙星和氨苄西林的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）。

1.6 联合药敏试验 采用棋盘法进行联合药敏试验［4-5］，以部分抑菌浓度（Fractional Inhibitory Concentration，FIC）评价61 种藏兽医药用植物水提物与抗菌药物联用对SCP-ExP-coli2017-4307 株的抑制作用。当FIC≤0.5 时表示协同作用；0.5＜FIC≤1 时表示相加作用；1＜FIC≤2 时表示无关作用；FIC＞2时表示拮抗作用。

2 结果

2.1 61 种藏兽医药用植物水提物对SCP-ExPcoli2017-4307 株的抗菌效果评价 61 种藏兽医药用植物水提物对SCP-ExP-coli2017-4307 株的MIC值分布见图1和表1。

表1 61种藏兽医药用植物和5种抗菌药物对SCP-ExP-coli 2017-4307株的MIC值

图1 61种藏兽医药用植物水提物对SCP-ExP-coli 2017-4307株的MIC值分布

川西獐牙菜、大托叶云实、牛尾蒿、乌奴龙胆、角茴香、角蒿、沙棘、乳白香青、秦艽、唐古特乌头、喜马拉雅紫茉莉、藏茴香12 种药用植物对SCPExP-coli2017-4307株的MIC值为15.625 mg/mL；山苦荬、止泻木、水柏枝、川西小黄菊、甘青青兰、甘青瑞香、红花绿绒蒿、异叶青兰、芫荽、垂头菊、兔耳草、草木犀、砂生槐子、点地梅、珠芽蓼、烈香杜鹃、臭蒿、高山绣线菊、高原毛莨、唐古特铁线莲、藏紫草、匙叶翼首草22 种药用植物对SCPExP-coli2017-4307 株的MIC 值为31.25 mg/mL；白苞筋骨草、肉果草、黄帚橐吾、瑞香狼毒、褐毛橐吾、螃蟹甲6 种藏兽医药用植物的MIC 值为62.5 mg/mL；大籽蒿、山矾、灰枝紫菀、花锚、白花刺参、草玉梅、夏至草、镰形棘豆、湿生扁蕾、锡金报春、褐毛风毛菊、藏党参12种药用植物对SCPExP-coli2017-4307株的MIC值为125 mg/mL；手参、高原蚤缀、纤毛婆婆钠、紫花黄华4 种药用植物对SCP-ExP-coli2017-4307 株的MIC 值为250 mg/mL；白花油麻藤、假耧斗菜、绵参、斑唇马先蒿、腊肠果5 种药用植物对SCP-ExP-coli2017-4307株的MIC值≥500 mg/mL。

2.2 61 种藏兽医药用植物水提物和抗菌药物联用的效果评价 61种藏兽医药用植物水提物与5种抗菌药物联用对SCP-ExP-coli2017-4307 株的FIC 值见表2。由表2 可知，61 种药用植物与5种不同种类抗菌药物联用未表现出协同作用；61 种药用植物与氟苯尼考、恩诺沙星联用均表现出无关或拮抗作用；垂头菊、臭蒿、藏紫草与四环素联用表现出相加作用，其余58 种药用植物表现出无关或拮抗作用；大籽蒿、川西小黄菊、手参、红花绿绒蒿、芫荽、花锚、垂头菊、猪牙蓼、臭蒿、高山绣线菊、唐古特铁线莲、紫花黄华、褐毛风毛菊、藏紫草、锡金报春15 种药用植物与链霉素联用表现出相加作用，其余46种药用植物表现出无关或拮抗作用；止泻木、川西小黄菊、手参、白苞筋骨草、垂头菊、猪牙蓼、高山绣线菊、唐古特铁线莲、紫花黄华、藏紫草、锡金报春11 种药用植物与氨苄西林联用表现出相加作用，其余50 种药用植物表现出无关或拮抗作用。

表2 61种藏兽医药用植物和5种抗菌药物联用对SCP-ExP-coli 2017-4307株的FIC值

3 结论

本研究对采自折多山至康定机场沿线路段的61 种代表性藏兽医药用植物水提物进行抗菌活性评价，结果显示55.74%（34/61）的药用植物对致病性大肠杆菌SCP-ExP-coli2017-4307株表现出较强的体外抗菌活性（MIC≤31.25 mg/mL）。其中，大托叶云实、川西獐牙菜、牛尾蒿、乌奴龙胆、角茴香、角蒿、沙棘、乳白香青、秦艽、唐古特乌头、喜马拉雅紫茉莉、藏茴香12 种药用植物的MIC 值为15.625 mg/mL，提示这些药用植物在一定程度上可以作为替代抗菌药物的候选目标。

此外，本研究还初步探讨和比较了61种藏兽医药用植物与5种常用抗菌药物联合应用的药效学差异。结果表明，白苞筋骨草、垂头菊、臭蒿、川西小黄菊、大籽蒿、手参、红花绿绒蒿、芫荽、花锚、高山绣线菊、唐古特铁线莲、紫花黄华、褐毛风毛菊、锡金报春、止泻木、川西小黄菊、藏紫草、猪牙蓼18种藏兽医药用植物水提物与四环素、链霉素、氨苄西林联合应用对致病性大肠杆菌SCPExP-coli2017-4307 株表现出相加作用，其中以垂头菊和藏紫草的相加作用最为广泛。在后续研究中，可以重点关注垂头菊和藏紫草的资源分布，并对其不同提取部位进行抗菌活性物质分析和抗菌机制探讨。