禽蛋和禽肉中兽药残留检测技术研究进展

洪 璐,刘书余,郭亚文,高鹏飞,朱雅丽,谢恺舟*

(1.扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州 225009; 2.扬州大学,教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室,江苏扬州 225009)

近几年我国肉制品的需求增长很快,随着人均收入的提高及肉产品成本的下降,人们对于日常所需肉制品的数量及质量增高明显,其中,禽类产品是优质蛋白的重要来源之一[1],其含有丰富的蛋白质、维生素及矿物元素,容易被人体吸收利用,鸡蛋中更是富含卵磷脂,有营养大脑神经以及减轻肝损害等的作用,是人们日常饮食中不可缺少的一部分。同时,伴随而来的食品安全问题也就越加严峻。在养殖业中,兽药是畜禽疾病防治过程中最基础且最关键的一道环节,它可以保证动物健康生长和生命安全,同时决定着一个企业的兴衰以及消费者的健康。合理、科学地使用兽药是每一个养殖企业经营的基本原则。但随着人们对禽类产品的需求日渐增长,部分养殖企业,尤其是小型养殖户为了谋取利益,不遵守休药期、不按规定用药以及在饲料中过度添加某些药物而导致禽类产品中兽药残留超标问题日益加重[2]。为了监测和控制禽蛋和禽肉中有害物质的残留,发展了不同的样品前处理技术及兽药残留检测技术,为大众和环境的安全作保障。综上所述,本文综述了禽蛋和禽肉中兽药残留常用的前处理方法和测定方法,并对兽药残留检测技术未来的发展进行了展望。

1 我国禽蛋和禽肉的兽药残留现状

兽药残留种类主要包括抗生素类、磺胺类、呋喃类、抗寄生虫类、激素和β-兴奋剂等药物的残留[3]。其中,以促进禽类生长的激素、抗生素、磺胺类等药物的残留最为常见[4]。兽药残留的超标,可能引发慢性中毒和肠道菌群失调,甚至会产生“三致”(致畸形、致癌变、致突变)作用[5]。

禽蛋、禽肉中兽药残留主要来自家禽促生长时期和疾病防控时期,在这两个期间,很多养殖户因未按规定用药,未严格执行休药期等原因,导致动物源性食品中的兽药残留问题愈演愈烈,从而使药物原型及其代谢物蓄积在家禽体内,并转移到禽肉及禽蛋产品中[6]。

2022年,在我国农业农村部组织开展了的农产品质量安全监测工作中,抽检了31个省份的屠宰场和养殖场共833个、农产品批发市场1191个。抽检结果显示,畜禽产品的合格率为99.1%。其中,禽肉和禽蛋类的抽检合格率分别为98.7%和98.1%,合格率较其他的农产品低。

禽蛋、禽肉中的兽药残留种类繁多,问题不断加剧的原因还包括养殖规模持续扩大、兽药成分问题、检测水平不够及市场监管不到位等几个方面[7]。本文结合GB 31650-2019、GB 31650-2022对禽蛋、禽肉中残留兽药及药物的最大残留限量进行了总结,如表1。

表1 GB 31650-2019、GB 31650-2022 中规定的禽蛋和禽肉中兽药残留的最大残留限量Tab 1 MRLs of veterinary drug residues in poultry eggs and poultry meat in GB 31650-2019 GB、31650-2022

2 样品前处理方法

禽类产品中蛋白质含量较高,尤以鸡蛋中蛋白质含量最为丰富,在检测过程中会对目标物的萃取净化造成干扰,因此,选择适宜的样品前处理方法对残留药物的定性和定量至关重要[8]。前处理的步骤主要包括萃取、纯化、分离、浓缩和复溶等。萃取和纯化是最为关键的两步。

目前,在禽类产品中运用较多的有液-液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、加速溶剂萃取(ASE)、QuEChERS[9]和基质固相分散萃取(MSPDE)等。

2.1 液-液萃取 液-液萃取,也称两相溶液提取,因样品中各成分在两种互不相容的溶液中存在着分配系数差异而能达成分离效果的萃取方法。萃取基本过程是将萃取液加入到样品溶液中充分混合后,因浓度高低促使这些成分从样品溶液中向萃取液中扩散,从而达到分离效果。曲良娇等[10]用5%三氯醋酸来萃取鸡肉中的五氯酚,经过五氯酚钠(SLC)专用柱进化后,再用气相色谱-质谱内标法进行样品分析。五氯酚在5.05～202 μg/L浓度内线性良好,r=1.000,检出限为0.06 μg/kg。Wang 等[11]利用乙酸乙酯提取鸡蛋中喹诺酮类和磺胺类药物,经过两次浓缩过滤后,再用超高效液相色谱-质谱联用法对样品进行检测分析,结果显示,线性相关系数均在 0.9990以上,检出限为 2～10 μg/kg-1。该法具有分离效果好、回收率高和适用性高等优点,但繁琐费时,萃取溶剂易挥发,因此常与其他前处理方法配合应用。

2.2 固相萃取 固相萃取是一种液相色谱分离技术,是采用固体吸附剂将液体样品中的目标物与干扰物分离,从而达到目标物的分离和集合。此方法已被许多领域广泛应用。傅红雪等[12]运用1∶1的乙腈-1%三氯乙酸溶液混合液为提取剂, 经Hilic Plus亲水色谱柱净化后, 运用全自动固相萃取结合液相色谱-串联质谱法测定了鸡肉中7种抗病毒药物残留。秦宇等[13]建立了用1% 甲酸乙腈为萃取剂,经新型固相萃取柱净化后结合超高效液相色谱-串联质谱法测定了鸡蛋中克伦特罗、恩诺沙星和金刚烷胺等 12 种禁用兽药的残留量,为鸡蛋中多种兽药残留分析检测提供了规范的依据。该法具备简单、快速和通量高等优点,但固相萃取柱成本高且对环境有一定的污染。

2.3 加速溶剂萃取 加速溶剂萃取是一种只需利用少量基质,在一定的高温和压力下自动萃取基质中有机物的技术[14]。张健威等[15]建立了一种以甲醇和0.1 mol/L Mcllvaine缓冲液为萃取溶剂,利用加速溶剂萃取-固相萃取-超高效液相色谱/三重四极杆质谱法测定沉淀物中10种磺胺类抗生素的分析方法,结果表明,该方法检出限为0.034～0.396 ng/g;平均回收率67.8%～109.8%之间,可应用于沉淀物中磺胺类抗生素的残留检测。该法具有操作简单、省时、回收率显著和对基质破坏度小等优点[16],但设备价格昂贵,成本较高[17]。

2.4 QuEChERS QuEChERS是由美国农业部开发的一种样品前处理方法,广泛应用于农畜产品的检测,具有快速、高效和安全等特点[18],但过程中易受基质干扰。QuEChERS法净化的基本过程是向水溶液中的固体样品加盐后经过乙腈萃取,接着经过液固萃取(也称分散机制萃取)去除乙腈中存在的大部分干扰物,将萃取后的样品直接进行质谱分析。吕警[19]以QuEChERS法萃取和净化鸡肉样品,并结合液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)对样品进行检测分析,建立了一种可以快速测定鸡肉中8种喹诺酮类药物残留量的方法。该法简单、高敏、净化效果明显、所得平均回收率为89.7%～97.7%。图雅等[20]用QuEChERS前处理法,结合超高效液相色谱-质谱法,建立了一种能够快速筛查禽蛋(鸡蛋、鸭蛋和鹅蛋等)中2种四环素类药物残留的方法,该方法灵敏度及准确度良好,所得平均回收率为80.5%～104.2%。

2.5 基质固相分散萃取 基质固相分散萃取(MSPDE)是一种将萃取物与待测样品置于同一容器内研磨为半干状态的混合物后作为材料装柱,然后用不同的溶剂洗脱待测的残留物[21]。该法是美国的Barker教授提出并进行了理论解释的一种样品前处理技术[22]。Zhang等[23]以分子印迹基质固相分散萃取技术并结合高效液相色谱(HPLC)法对样品进行检测分析,建立了一种可以系统监测鸡肉中奥拉喹多克的便捷有效的分析技术,该法具有很好的识别性和选择性,奥拉喹多司在1.0和2.0 μg/g-1水平的回收率范围在85.3%～93.2%之间。该法具有操作简单,高效和试剂消耗少等优点,在处理过程中可有效的减少样品损失,但成本高、局限性高。表2总结了以上五种前处理方法的优缺点对比。

表2 不同样品前处理方法优缺点对比Tab 2 Comparison of advantages and disadvantages of different sample pretreatment methods methods

2.6 其他样品前处理方法 现今,随着兽药残留检测技术的不断发展,已广泛应用的样品前处理方法还包括震荡萃取(OE)、超声萃取(UE)、旋涡混合萃取和沉淀法等[24]。这些方法都有精确度高,耗时短及成本低的优点。

3 常用检测方法

目前,禽蛋、禽肉中兽药残留常用的传统检测方法有(超)高效液相色谱法[(U)HPLC]、(超)高效液相色谱-质谱法[(U)HPLC-MS]、气相色谱-质谱法(GC-MS)等[25]。

3.1 (超)高效液相色谱法 (超)高效液相色谱对于分子量高、气化难度大、热波动不稳定及高沸点兽药的测定效果好。该法具备灵敏度高、分离效果好和对温度变化不敏感等优点。高效液相色谱-检测器主要有紫外线检测器(UV)、荧光检测器(FD)、化学发光检测器(CD)和蒸发光散射检测器(ELSD)等,可根据检测目标选择合适的检测器。我国《食品安全国家标准鸡可食性组织中地克珠利残留量的测定高效液相色谱法》(农业部1927号公告-21-2013)[26]、《食品安全国家标准鸡可食性组织中尼卡巴嗪残留量的测定高效液相色谱法》(农业部1927号公告-11-2013)[27]中规定对鸡蛋中氟喹诺酮类药物、磺胺喹噁啉和泰乐菌素的残留测定运用高效液相色谱法。刘畅等[28]以三氯乙酸-乙腈为提取剂,运用固相萃取结合高效液相色谱测定了禽类可食性组织和蛋中氨丙啉残留,该方法精准度高,可用于禽肉及禽蛋中氨丙啉残留的检测。

3.2 (超)高效液相色谱-质谱法 近年来,(超)高效液相色谱-质谱法的发展很快,具有灵敏度高、分析速度快、样品用量少和专属性强等优点[29],因此,应用领域越来越广泛,随着该技术的发展,我国相关标准中对兽药残留的检测大多运用液质联用。随着动物源性食品中的兽药残留越发复杂,出现多种或未被发现的化学物质残留,我国需要发展更加全面的检测技术和仪器,提升识别手段。陈涛等[30]建立了一种基于超高效液相色谱-质谱法同时测定鸡蛋、鸡肉、猪肉中酰胺醇类药物残留量的方法。晏亮等[31]运用5%甲酸乙腈溶液为提取剂,运用QuEChERS法结合超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法,建立了同时测定蛋及蛋制品中 5 大类 49 种药物残留的方法。该方法快速又简便,大大提高了工作效率。奚照寿等[32]以乙酸乙酯-乙腈-氨水为提取剂结合高效液相色谱-串联质谱法,建立了鹌鹑蛋和鸽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢产物氟苯尼考胺多残留的同时检测方法。

3.3 气相色谱-质谱法 气相色谱-质谱法结合了气相色谱和质谱的不同特性以鉴别样品中不同物质,其原理是将待测样本分子电离成不同质量电荷比的带电离子进行分离[33]。目前,该法主要用于检测食品中易挥发的小分子痕量化合物,其在兽药残留方面的应用没有上述两种方法广泛。我国《食品安全国家标准 鸡肌肉组织中氯羟吡啶残留量的测定气相色谱-质谱法》(GB 29699-2013)[34]规定了鸡肌肉组织中氯羟吡啶残留量的检测标准。邢银英等[35]以三重四极杆气相色谱-串联质谱法结合QuEChERS法,建立了禽源类肉及其肉制品中氟虫腈及3种代谢药物残留的分析方法,该法准确度和灵敏度均很高。

4 其他检测方法

常用的检测方法所需仪器较大,耗费高且检测环境有很大的局限性。如今,兽药残留检测技术不断的向着新的方向发展,国内外已广泛应用于食品中的快速检测技术包括免疫学检测法、分子印迹技术、生物芯片技术、生物传感器检测法等。

4.1 免疫学检测法 免疫学检测法是一种广泛应用于农药残留的检测的方法,该法包括联酶免疫检测法、荧光免疫检测法、胶体金免疫检测法和免疫传感器技术[36]。以酶联免疫检测法为例,其检测原理如图1,该法具有操作简单、省时和准确率高等特点[37]。何方洋等[38]运用化学发光免疫分析法、酶联免疫分析法和胶体金免疫层析法三种免疫学检测法对动物源性食品(鸡肉等)中的呋喃唑酮进行检测,结果表明,发光免疫分析法、酶联免疫分析法、胶体金免疫层析法对呋喃唑酮代谢物的检测限分别为0.01、0.02、50 ng/L,发光免疫分析法和酶联免疫分析法添加回收试验的变异系数范围分别为小于15.0%和小于8.0%。因此,不论是实验室检测还是户外的批量样本检测,不同的免疫学检测法在不同的应用条件下各有优势。

4.2 分子印迹技术 分子印迹技术(MIT)是指用化学方法合成对目标物具有特异选择性聚合物的过程[39],是利用模板记忆在聚合物基质中形成选择性位点创建分子印迹聚合物(MIPs)的技术[40]。其检测原理如图2,该法具有灵敏度高、操作便捷、成本低、稳定性好等特点[41]。李桥[42]等运用分子印迹技术,以金属有机骨架为稳定离子,通过皮克林乳液法制备了分子印迹中空微球,可用于检测动物性食品中的阿莫西林,结果表明,分子印迹中空微球对阿莫西林有较大的吸附容量,吸附容量在318 K,100 mg/L的阿莫西林溶液中达到0.1376 mmol/g。Ma等[43]用二甲胺四环素的分子印迹纳米聚合物聚合在金属有机骨架材料表面,以该种新型复合材料为吸附剂,建立了分散固相微萃取方法,用于鸡肉中7种四环素的超高效液相色谱测定方法。该复合材料对7种四环素具有较高的吸收能力,回收率可达92%以上,可重复使用8次。7种药物的检出限为0.2～0.6 ng/g,因此,该方法可用于肉类中四环素残留量的多重检测。

图2 分子印迹技术原理图Fig 2 Schematic diagram of molecular imprinting technology

4.3 生物芯片技术 生物芯片技术是一种利用杂交技术对食品基因进行检测的方法[44],此项技术实现了便携微型自动化处理[45],已广泛的应用于食品安全检测领域中。生物芯片的种类包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片和细胞芯片等[46]。以蛋白质芯片为例,其检测步骤如图3,相比其他生物技术,生物芯片技术具有消耗试剂少、结果可比性高等特点[47]。郭志红[48]运用蛋白芯片技术检测了鸡肉中盐酸克仑特罗、恩诺沙星、磺胺二甲嘧啶等的残留,结果表明每种药物在鸡肉中的回收率均在60%～120%,变异系数在25%以内。

图3 蛋白质芯片检测流程图Fig 3 Protein chip detection flowchart

4.4 生物传感器检测法 生物传感器主要是由识别元件(如抗原抗体)和信号转换器组成[49],可形象的如图4所示。该法具有准确性高、处理时间短和成本低等特点,该技术在国外发展很快,基本已广泛应用到各行各业中[50]。刘卫华[51]等运用氟苯尼考多克隆抗体成功构建了一种基于石墨烯-壳聚糖复合修饰材料的电化学免疫传感器技术检测鸡肉、鸡蛋中的氟苯尼考残留,结果表明,每次的回收率均在76.90%～94.30%之间。由此可见,生物传感器检测法可应用于大批量的样本检测,且检测的地域局限小。

图4 生物传感器检测法原理图Fig 4 Schematic diagram of biosensor detection method

5 展 望

兽药残留种类和途径十分复杂,目前已广泛应用于兽药残留检测的技术中,不论是前处理技术,还是样品的检测技术,都存在着一些如仪器体积大,造价高,检测地受限等缺点。我国虽已逐渐开始普及生态养殖,但现下这些绿色养殖法因成本、时间和技术等问题还未完全普及,应用并不广泛。因此,规范养殖、严格按规定使用兽药、加强市场监管和发展兽药残留检测技术手段仍然十分重要。微型、高通量、低耗材、低成本的兽药残留快速检测技术亟待完善,应用的领域也将更加广泛。