基因测序技术在单基因狼疮精准诊断和机制研究中的应用现状

杨智博 刘 力

1.天津市儿童医院 天津大学儿童医院综合内科（免疫）（天津 300074）；2.天津医科大学研究生院（天津 300070）

单基因狼疮是单基因变异引起的一类表现为狼疮样症状的自身免疫性疾病总称，多呈早发趋势，通常由儿童免疫科医师确诊。尽管该病因只占系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）发病的很小一部分，但了解其机制有助于临床医师深刻理解并精准诊疗SLE。单基因狼疮患者的临床症状与其他SLE 患者不同，以中枢神经系统疾病和皮肤症状为主，尤其是单基因狼疮患者会出现皮肤冻疮样皮损[1]。当患者临床症状不典型时，精确诊断仍需基因测序。相关研究指出，已有30多个单基因的100 多个位点变异可致SLE 表型[1]。这些发现加深了临床医师对于SLE 的理解，但其他未知的变异也是未来需研究的方向。有研究认为，SLE患者早发型或反复感染都应进行免疫检查和基因检测[2]。本文将从单基因狼疮概念，基因测序技术应用，以及单基因狼疮致病机制等方面进行分析，以期为其精准诊断和治疗提供方向。

1 单基因狼疮概念与诊断

单基因狼疮是SLE 中较为少见的分支，通常在儿童期发病，与家族遗传高度相关。研究表明，89.8%的患者符合欧洲抗风湿联盟/美国风湿病学会（EULAR/ACR）-2019 诊断标准，而93.9%患者符合系统性红斑狼疮国际临床协助组（SLICC）-2012诊断标准[3]，提示仅依据现有诊断标准判断SLE 患者是否为单基因变异所致很困难。但有研究发现，当SLE 患者满足以下条件时，应高度怀疑单基因狼疮：①早发型狼疮，首发年龄＜10岁；②高度怀疑或者已经确诊为免疫缺陷，或有反复感染史；③临床症状不典型；④病情严重，危及生命；⑤病程进展快，迅速恶化或器官损伤积累；⑥对治疗不敏感；⑦有家族史；⑧近亲结婚等[4]。还有一项基因异质性研究认为，当儿童早发型SLE 合并肾脏和血液系统疾病时，更可能为遗传病因所致[5]。同时，要精准诊断单基因狼疮，需要进行基因检测，而若要判断变异来源，对患者及直系亲属全部进行基因检测是精准诊断的前提。

2 基因测序技术概述及应用

基因测序技术可分为全基因组测序技术（whole genome sequencing，WGS）、全外显子测序技术（whole exome sequencing，WES）和靶向基因面板测序（a targeted next-generation sequencing panel，NGS）等。WGS和WES是广撒网式测序，而NGS通常只对目标基因进行测序。有研究提到，运用父母-子代一家系的样本进行WGS，可找到几乎所有的单核苷酸变异和绝大多数更小的插入-删除变异，同时确定许多变异的亲本来源[6]。通常对患者血液淋巴细胞中分离的DNA进行基因测序，利用现有数据库和测序平台分析找出变异位点，可诊断单基因狼疮[4-6]。而精准诊疗有赖于大量病例报道中基因测序确定的致病位点。

3 基因变异与单基因狼疮致病机制

由单基因变异引起的机体功能异常而致病的机制大致可分为以下几类：①细胞清除异常；②Ⅰ型干扰素（IFN-1）的过度产生；③自身免疫耐受受损；④其他单基因变异异常等。

3.1 细胞清除异常

细胞清除异常是指细胞程序性凋亡的产物不能被及时清除，从而引起自身免疫性疾病。其中吞噬细胞清除程序性死亡细胞的胞葬作用最重要。细胞清除异常时，任何残余产物均可作为损伤相关的分子标志物（damage-associated molecular patterns，DAMP），刺激免疫细胞活化和分化，触发免疫反应，引起自身免疫病。

3.1.1 补体系统缺陷 补体系统缺陷是单基因狼疮最早被发现且最常见的病因。补体系统参与凋亡细胞的识别、调理吞噬和清除作用。具体机制如下：当单基因变异导致补体缺陷时，凋亡细胞碎片和免疫复合物不能被清除，暴露成为自身抗原，刺激自身抗体产生，放大自身免疫效应，且持续损伤机体，从而表现出狼疮样症状。研究表明，早期补体蛋白（C1q、C1r/C1s、C2和C4）缺陷被认为是由于调理作用受损而触发自身免疫导致，这对清除免疫复合物和吞噬细胞凋亡小体至关重要[1]。还有研究指出，杂合的C2缺陷变异与低复制量的C4A同时存在时，是SLE 等疾病的重要危险因素之一[7]。有病例报道发现，当丝氨酸蛋白酶抑制剂家族G成员1（serpin family G member 1，SERPING-1）基因发生移码变异时，血浆中C1 抑制剂（C1-INH）的水平变低，遗传的C1-INH 缺陷会导致自发的早期补体经典途径活化，消耗患者血浆中C4，导致单基因狼疮[8]。还有研究发现，p.His198Gln变异的C1q和肿瘤坏死因子相关蛋白4（C1q and tumor necrosis factor related protein 4，C1QTNF4）蛋白在TNF-α 刺激下抑制NF-κB 的激活，该变异位于C1q 第二结构阈，在C1QTNF4基因中功能改变也可导致早发型SLE[9]。

需注意的是，补体缺陷与早发型狼疮相关，但其性别比差异不大，关节炎多见C2缺乏，狼疮肾多见C4A/ C4b 缺陷，抗核抗体（ANA）常见，但只有20%的患者显示抗ds-DNA，相反，抗Ro/SSA抗体在80%的C1q和C4缺陷患者中呈阳性，补体遗传缺陷中也可见血清总补体CH50水平低下和正常的血清C4、C3水平[10]。具有狼疮样表现和高ANA滴度（＞1:1000）的儿童，尤其是发病初症状非典型的，如复发性肺炎和支气管扩张，也应该考虑C4缺乏型单基因狼疮[11]。总之，单基因变异引起的补体系统缺陷很可能导致患者表现为狼疮，通常早发、严重且可追溯家族史，变异引起细胞清除异常是导致单基因狼疮的主要致病机制之一。

3.1.2 核酸降解相关酶缺陷 基因组广泛关联研究（genome wide association studies，GWAS）已发现30 多个单基因的100 多个位点变异导致SLE 表型，如TREX1、SAMHD1、DNASE1、DNASE1L3、TMEM173等，与单基因SLE 的脱氧核糖核苷酸1（deoxyribonuclease 1，DNASE1）密切相关，脱氧核糖核苷酸1样3（deoxyribonuclease 1 like 3，DNASE1L3）基因编码的主要酶可以分裂单链和双链DNA，并从病原体和凋亡细胞中去除外源DNA和自体DNA[12]。DNASE1/DNASE1L3基因缺陷导致细胞外核酸的积累，血浆中低于120bp的短DNA分子数量增加与抗dsDNA抗体的存在有关[13]，而携带长DNA分子的微粒具有免疫原性，与其相关的抗原可能会造成狼疮肾损害[14]。这些胞外累积的核酸也可被toll样受体（TLR7和TLR9）等DNA/RNA传感器识别，导致IFN-1的过度生成，从而导致单基因狼疮。有学者认为，症状早发、肺出血、肾小球肾炎、复发性荨麻疹和抗中性粒细胞抗体（ANCA）阳性等表现提示临床上要警惕单基因狼疮，特别是青少年SLE中DNASE1L3缺陷的单基因狼疮[15]。基因测序应用有助于发现这些基因变异位点。

3.2 干扰素过度产生

IFN 是可以限制病毒复制组装的抗病毒细胞因子。尽管IFN-1 可以保护机体免受病毒侵害，但IFN-1 的过度产生同样会使患者出现单基因狼疮。IFN-1 的过度表达可以通过以下机制发生：核酶活性的缺陷（TREX1、SAMHD1、ADAR1、RNASEs、DNASEs），IFN 信号抑制调控因子的缺陷（ISG15、USP18）和先天免疫传感器的组合活化（MDA5、RIG-I、STING）等[1]。IFN-1 与异二聚体受体（IFNAR1和IFNAR2）结合，激活Janus 激酶（JAK）-信号转导和转录激活因子（STAT）信号通路，诱导数百个干扰素刺激基因（interferon-stimulated gene，ISG）的转录[1]。这些途径的任何编码基因发生变异时都会导致IFN-1 的过度表达，从而导致Ⅰ型干扰素疾病，如单基因狼疮。

例如，Aicardi-Goutières 综合征（AGS）就是一种典型的Ⅰ型干扰素疾病，它是由单基因变异引起，表现为狼疮样症状的综合征。对于早发的冻疮样皮损、神经系统症状（颅内钙化、白质病变、肌张力异常）、发育迟缓、自身免疫抗体阳性、SLE 临床表现不典型或常规治疗无效的SLE 患者，应考虑AGS[16]。宿主DNA可以通过干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）变异触发胞浆内的固有传感器，并激活干扰素产生和ISG 的表达上调[17]。所有携带DNA 代谢酶的功能缺失性变异（如TREX1或SAMHD1）或DNA传感器/适配器功能获得性变异（TMEM173/STING1）的患者在AGS或婴儿发病的STING 相关血管炎（SAVI）这两种疾病中都分别表现出高且持续的ISG 表达[17]。说明了ISG 的表达增加在相关疾病发病机制中的关键作用。

脊椎软骨发育不良伴免疫调节异常（SPENCDI）也属Ⅰ型干扰素病，是一种罕见的常染色体隐性遗传的骨骼发育不良，以椎体和干骺端放射性病变为特征[18]，其免疫调节异常可以表现为SLE 等自身免疫病。该病由抗酒石酸酸性磷酸酶5（acid phosphatase 5，ACP5）基因纯合变异导致的酒石酸抗性酸性磷酸酶（TRAP）失活所引起[19]，在非核酸相关的刺激/调节Ⅰ型干扰素途径中发挥作用[18-20]。当该病患者的免疫调节异常表现为狼疮时，这也是一种单基因狼疮。

3.3 自身免疫耐受受损

SLE 患者体内广泛存在自身抗体，当某些基因变异时，自身反应性T细胞或B细胞无效清除，对其阴性选择失效就会触发自体免疫和耐受受损，从而发生自身免疫性疾病，如单基因狼疮。

3.3.1 T 细胞免疫耐受受损 鼠类肉瘤病毒基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）基因变异时，增强了丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路（RAS-MAPPK）的传导信号，刺激淋巴细胞增殖，并抑制T 淋巴细胞凋亡，导致单基因狼疮等症状出现，在临床上称为Noonan 综合征。如NRAS、SOS1、PTPN11、RAF和SHOC2等基因变异也与Noonan综合征相关[10]。

3.3.2 B细胞免疫耐受受损 蛋白激酶Cδ（protein kinase C delta，PRKCD）基因编码的蛋白激酶Cδ（PKC-δ）是一种促凋亡因子，作用于B细胞的凋亡。当PRKCD基因纯合错义变异时，PKC-δ表达降低，B 细胞凋亡减少导致未成熟的B 细胞过度聚集，自身抗体增多，形成免疫复合物而出现一系列自身免疫性疾病症状[10]。

TLR7 是一种病毒RNA 的传感器，TLR7 信号传导增强也是自身免疫性疾病的一种发病机制。相关研究发现，由于TLR7 功能获得性变异引起对鸟苷的亲和力增加，TLR7激活阈值降低会导致B细胞驱动自身免疫，造成SLE等自身免疫疾病[21]。TLR7促进了被B 细胞受体激活的高自身反应性未成熟B细胞的异常存活，并以细胞固有的方式累积CD11c+年龄相关B 细胞和生发中心B 细胞，滤泡和滤泡外辅助性T 细胞也随之增加。虽然人类TLR7Y264H变异足以在小鼠中诱导出狼疮，但除了增加Ⅰ型干扰素基因转录外，对核苷酸酶H2亚基B（ribonuclease H2subunit B，RNASEH2B）半合子没有明显的增加效应，在存在环境因素刺激的情况下，该变异在人类中的作用可能会增加，包括依赖TLR7 免疫的单链RNA病毒，如新冠病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）等[22]。这证明了失调的TLR7 能够驱动自身抗体产生和SLE 的发生，或许可以为治疗单基因狼疮提供新思路。

P2Y受体8（P2Y receptor family member 8，P2RY8）是一种在抑制生发中心B细胞迁移和生长调节中具有既定作用的受体，P2RY8 杂合错义变异同样会对B 细胞免疫耐受造成损伤并导致SLE 症状。低P2RY8水平与狼疮性肾炎相关，与年龄相关B细胞和浆细胞的增加相关[23]。编码区变异或某些环境因素可以损害狼疮患者的P2 RY8 功能，导致P2RY8减少。

3.4 其他单基因变异引起的狼疮

有病例报道，在单基因狼疮患者中发现了脂多糖应答性米色样锚定蛋白（lipopolysaccharideresponsive beige-like anchor protein，LRBA）基因变异缺陷[24]。LRBA促进细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA4）表达，SLE患者的T细胞在激活时不能上调CTLA4，该通路的改变则可能是LRBA 缺陷导致单基因狼疮的致病机制。

某些狼疮继发于单基因变异引起的原发性免疫缺陷类疾病。如RAG1、NRAS、PIK3CD、PSYPIP1、TNFAIP3等单基因杂合变异引起原发性免疫缺陷疾病，都可能继发狼疮[25]。此外，胞质分裂作用因子8（dedicator of cytokinesis 8，DOCK8）缺陷导致的高IgE综合征也会表现为SLE[26]。

4 结论与展望

近年来，随着基因测序技术在SLE 患者诊断及研究中的广泛应用，很多单基因相关的变异被发现，其中有许多罕见变异位点，也有越来越多的儿童患者及其家庭愿意参与基因测序来寻找病因，为深入了解单基因狼疮的致病机制提供了思路与方向。相关研究分析表明，罕见变异所受到连锁不平衡的影响远小于常规变异[27]。已有学者把已经发现的31 个单基因狼疮变异位点（C1QA、C1QB、C1QC、C1R、C1S、C2、C3、TREX1、RNASEH2A、RNASEH2B、RNASEH2C、SAMHD1、ADAR、DNASE1、DNASE1L3、PRKCD、ACP5、SLC7A7、IFIH1、TMEM173、ISG15、CYBB、FAS、FASLG、KRAS、NRAS、MAN2B1、PEPD、PTPN11、RAG2、SHOC2）作为靶向基因，运用NGS诊断自身炎性疾病。所有早发型SLE患者，无论有无家族史，都应该通过NGS检测单基因缺陷[28]。总之，大部分变异都是通过影响炎症通路和机体免疫调节产生自身抗体或有害炎症因子，通过其持续作用而导致自身免疫性疾病如单基因狼疮的发生。

过去，狼疮的治疗药物选择有限，大多采用激素和免疫抑制剂等非特异性治疗，但随着对单基因狼疮认识的加深，既有助于更全面了解SLE 这类疾病，也可为针对不同的致病途径进行精准阻断治疗提供新的方向和依据。比如，贝利木单抗是一种人源性单克隆IgG抗体，可抑制B淋巴细胞刺激因子，导致B 细胞数量减少并调节其功能，可有效缓解成人SLE 患者的皮肤和关节症状，也有其治疗儿童单基因狼疮患者（C1q 缺陷）后关节炎症状得到完全缓解的先例，因此贝利木单抗可作为一种辅助治疗应用于难治性单基因狼疮患者[29]。此外还有其他治疗手段，如某病例报道中提到的，应用造血干细胞移植治疗表现为SLE 的DOCK8 缺陷患者[26]。补充DNASE1L3也可以作为一种疗法，用来帮助该种缺陷的患者[13]。更有新鲜冰冻血浆和造血干细胞移植应用到C1q缺乏的早发型SLE患者中，替代由单核细胞产生蛋白缺失的先例等[30]。

尽管已有很多前期研究，但由于该病患者基数小且大部分为儿童，诊疗与成人患者相比更具有局限性和不确定性，对单基因狼疮的认识仍不足。在未来，发现更多可能的变异位点，厘清发病机制仍是研究单基因狼疮的努力方向，精准诊疗等也需要更深入的讨论和验证。