儿童克罗恩病早期筛查和诊断研究进展

汪陈慧综述 杨 辉审校

南京医科大学附属儿童医院消化科（江苏南京 210008）

克罗恩病（Crohn’s disease，CD）是一种慢性非特异性消化道炎性疾病，属于炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的一个亚型，临床表现为反复腹痛、腹泻，伴明显体重下降，可有腹部肿块、肠瘘、肛周病变以及发热、贫血、生长发育迟缓等全身性表现[1]。目前CD 的病因和发病机制尚不明确，主流观点认为，环境因素、遗传易感性和免疫反应失调与CD 的发生发展密切相关。近年来，儿童CD 的发病率显著增加，成为一种全球性的儿科疾病。在世界范围内，儿童CD 发病率在0.2/100000～13.9/100000之间，中国儿童CD发病率目前尚不清楚，但呈逐年上升趋势[2]。因为起病隐匿，临床表现不具特异性，而且缺乏非侵入性的诊断方法，儿童CD 的早期诊断往往很困难。Ricciuto等[3]分析加拿大111 例IBD 患儿的诊断时间发现，诊断延迟在CD中更为常见，儿童CD从出现症状至确诊的中位时间为6.8个月，其中约20%的患儿诊断延迟时间超过1年。然而CD具有进展性和致残性，诊断延迟与CD并发症和需要手术的风险增加相关，CD 患儿诊断延迟可导致肠道狭窄和内瘘的发生率升高2.5倍(HR 2.53，95%CI1.41～4.56)，诊断延迟每增加1个月，年龄别身高z分下降0.13个标准差(95%CI0.005～0.021)[4]。因此早期诊断和干预可减少CD 患儿并发症的发生，降低手术率和致残率，改善长期预后，提高患儿的生存质量。

目前，儿童CD 的临床诊断需要结合临床表现、内镜检查、组织病理学以及影像学检查进行综合分析[1]，其中内镜及组织病理学检查最为关键[5]，然而它具有侵入性，不利于儿童的早期筛查和诊断。众多临床研究表明，对于出现非特异性胃肠道症状的患儿，采用一些非侵入性及耐受性良好的手段，可尽早筛查出需要内镜检查的CD高危患儿，缩短出现症状至确诊的时间。本文就CD 患儿早期识别的筛查手段和诊断方法进行综述。

1 影像学检查

肠道超声（intestinal ultrasound，IUS）是疑似CD的有效筛查手段之一，常见的CD 征象包括肠壁增厚、肠道弹性和蠕动降低、肠壁回声改变等，其中最可靠的是肠壁增厚（bowel wall thickening，BWT）[6]。与其他非侵入性检查联合应用时，其灵敏度和特异度会显著提高。一项针对患儿进行IBD 筛查的研究发现，BWT（＞3 mm）和粪便钙卫蛋白（fecal calprotectin，FC，＞200 μg/g）联合检测能显著提高诊断准确率，阳性预测值为100%，阴性预测值为88.5%，其中，BWT（＞3 mm）单项检测特异度最高（96%），灵敏度较低（70%）；FC（＞200 μg/g）灵敏度最高（96%），但特异度较低（72%），相反FC、血液炎症指数和BWT 三项检测均正常的儿童发生IBD的概率几乎为0；FC和增加的BWT可较准确地指导对有轻度胃肠道症状的患儿进行进一步的侵入性检查[7]。

CD在CT和磁共振成像（magnetic resonance，MRI）上常见的特征包括异常肠壁增厚伴强化和肠壁分层、肠系膜血管增多(梳状征)、结肠周/肠周脂肪堆积和纤维脂肪增生等。目前，临床评估CD最常用的影像学检查方法是磁共振小肠成像（magnetic resonanceenterography，MRE）和CT小肠成像（CT enterography，CTE），然而，由于电离辐射、软组织对比度差等原因，CTE 比MRE 更受限制，尤其在儿童中，MRE被认为是诊断和跟踪儿童CD的一线方法[1]。但是，MRE 需要儿童口服大剂量的造影剂，长时间的检查、镇静和较高的费用，因此在临床上，有非特异性胃肠道症状的儿童往往首选影像学检查不是MRE，相较而言常规腹部CT 更为常见。Kang 等[8]将诊断为CD 前进行腹部CT 的患儿纳入CD 组，将诊断为感染性小肠结肠炎前进行CT 检查的患儿纳入对照组，研究他们的CT 和实验室检查结果，发现多节段肠道受累和较低的白蛋白水平(≤4 g/dL)是CD 的重要危险因素，当这两个特征相结合时，曲线下面积（area under curve roc，AUC）为0.985，鉴别CD的灵敏度为96%，特异度为100%。因此，CT多节段肠道受累和白蛋白降低有助于早期鉴别CD 与感染性小肠结肠炎。

小肠克罗恩病（small bowel Crohn’s disease，SBCD）的发病部位仅局限于小肠，在CD 患者中约占30%。对于CD患儿由于小肠的解剖结构和位置，内镜检查不易发现病灶，因此孤立的SBCD 往往很难诊断，也是诊断延迟的危险因素[4,9]。目前，MRE和CTE 是评估SBCD 常用的影像学检查方法[1]。MRE 可以提供极好的肠道细节，包括评估肠腔和肠壁、邻近的肠系膜和软组织，以及各种肠外腹盆腔CD表现，同时使儿童免受电离辐射暴露风险，可用于儿童CD 的早期诊断，特别是SBCD[10-11]。与MRE相比，小肠超声造影（small intestinal contrast ultrasonography，SICUS）更加经济、方便、快捷，适合早期筛查评估，可提供比MRE更高空间分辨率的图像，且不需要镇静或麻醉，耐受性更好，特别适用于年幼患儿[12]。一项回顾性研究评估了SICUS检测CD小肠病变的准确性和一致性，在疑诊CD患儿中，SICUS 诊断CD 小肠病变的灵敏度和特异度分别为81.8%和100%，与MRE和肠镜检查具有较高的一致性[13]。然而超声检查结果的精确性与检查者的经验及专业程度有关，因此多数医院开展受限。

此外，CD 患儿肛周病变的患病率较高，部分患儿首发症状即为肛瘘或肛周脓肿，其发病率约为24%[14]。肛周MRI可以确定肛瘘和肛周脓肿的范围和位置。与非CD 肛瘘患者比较，CD 肛瘘患者肛周MRI影像学特征以多分支、多脓肿、多内口数、高位内口、直肠炎和肛管炎高发为特征，且CD肛瘘患者比单纯表现为肛瘘患者更年轻[15]。因此，肛周MRI可提高CD肛瘘患儿的早期诊断率。

2 新型生物标志物

传统的儿童CD 标志物主要包括抗酿酒酵母抗体（ASCA）、抗乙糖苷甘露糖抗体（AMCA）、抗乙糖苷壳糖抗体（ACCA）等，它们属于多糖抗体，抗原多为细菌细胞壁中多糖成分。ASCA、AMCA 和ACCA都是对CD具有较高特异性的抗体。杨辉等[16]报道ASCA IgG、ASCA IgA 在CD 患儿的阳性率分别为50%、62.5%，高于AMCA IgG和ACCA IgA的阳性率（37%），显示ASCA 在CD 患儿中的特异性优于AMCA 和ACCA，但它们的检测灵敏度都较低。此外，ASCA在乳糜泻中也存在30%～40%阳性率，因此限制了其在CD患儿早期诊断中的应用。

FC是胃肠道中性粒细胞产生的一种蛋白，对儿童IBD 的检测具有很高的灵敏度，为0.92（95%CI0.84～0.96)，它在过敏性肠炎、胃肠道感染和乳糜泻等疾病中均可升高，主要缺点是儿童的特异度相对较差，为0.76（95%CI0.62～0.86），但是当FC水平很高（＞800 μg/g）时，可作为CD的筛查工具[17]。当FC 与其他炎症指标联合检测时，可弥补其特异度低的缺点。一项研究将其与及血清胆碱酯酶（cholinesterase，ChE）、降钙素原（procalcitonin，PCT）联合检测时，ROC 0.973，分别以FC＞96.17 μg/g、血清ChE＜7 537.61 U/L、PCT＞0.56 μg/L为诊断IBD的临界值，联合检测的灵敏度为94.0%，特异度为90.0%，对儿童IBD的早期诊断价值较好[18]。

目前有报道，新型的生物标志物如抗克罗恩病肽353（anti-Crohn's disease peptide 353，ACP353）、抗糖蛋白2（glycoprotein 2，GP2）应用于儿童CD的诊断[16]。最近，一项来自日本儿童的研究表明，ACP 353、抗GP2 和ASCA 在CD 患儿中的浓度（中位数分别为2.25、3.0 和8.9 U/mL）显著高于溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC，1.1、1.9和3.4 U/mL，P＜0.001）、其他肠道疾病（1.1、1.85和2.95 U/mL，P＜0.001）和健康对照组（1.1、1.7和2.8 U/mL，P＜0.001）。在95%特异度时，ACP353的灵敏度为45.0%，显著高于抗GP2（30.8%，P＜0.05）或ASCA（26.7%，P＜0.01）[19]。这一结果显示，ACP 353 对于CD 患儿的早期诊断具有较高价值。抗GP2 也是一个CD 标志物。一项包括53例CD 患儿的队列研究显示，与UC 患儿（42 例）和对照组（53 例）比较，CD 患儿抗GP2 水平显著升高（P＜0.05），抗GP2-IgG 和IgA 的特异度高达98.7%和90.0%，但灵敏度较低，分别为42.0%和35.5%[20]。病变累及回结肠的CD患儿抗GP2-IgA水平也显著升高，这一现象在低龄患儿更明显。此外，粪便几丁质酶3样蛋白-1（chitinase3-like protein 1，CHI3L1）对成人CD有较高的诊断价值[21]，但目前仍缺乏儿童CD的研究报道。CHI3L1是一个中性粒细胞自身抗原靶点，CHI3L1-IgA和SIgA可作为CD的新标志物有助于CD诊断[21]。

微小RNA（miRNA）是一类由内源性基因编码的长度约为22～24个核苷酸的非编码单链RNA，在CD 中参与促炎细胞因子的产生和炎症过程。血循环和肠黏膜组织中的miRNA 被认为是预测CD 的新型生物标志物。一项采集CD 患儿、健康对照组和腹腔疾病患儿对照组的血清样本进行miRNA 检测的研究显示，11 种CD 相关的血清miRNA 包括miR-16、miR-484、miR-30e、miR-106a、miR-195、miR-20a、miR-21、miR-140、miR-192、miR-93、let7b被认为是可应用于诊断CD的非侵入性生物标志物，其灵敏度介于69.57%～82.61%，特异度介于75.00%～100%[22]。miR-146a在CD患儿炎症十二指肠黏膜中的表达明显高于CD组（3.21±0.50对0.62±0.26，P≤0.01）和对照组（3.21±0.50对1.00±0.33，P≤0.05）正常十二指肠黏膜；与对照组相比，十二指肠炎症区域的miR-155表达也显著增加（4.87±1.02对1.00±0.40，P≤0.001），提示肠黏膜miR-146 a 和miR-155 参与儿童CD 的发病[23]。此外，CD 患儿炎症结肠活检组织中miR-223表达明显高于CD组和对照组正常结肠黏膜[24]。迄今为止，关于儿童IBD 患者的miRNA 研究很少，Jabandziev等[25]统计了集中在儿童IBD患者的miRNA 研究发现，miRNA 谱有明显的重叠，其中miR-146a、miR-142-3p和miR223有希望成为未来儿科IBD 的潜在非侵入性生物标志物，此外，还有miRNA 生物标志物(如miR-24)能够准确区分UC和CD病例。

环境因素和易感基因之间的相互作用将不可避免地导致CD 患儿血清和炎性黏膜中蛋白质组图谱的显著改变，近年来这已被认为是CD 的潜在诊断生物标志物[26]。例如Torres等[27]检测了200例诊断前后CD 患者的血清，确定了51 种蛋白质生物标志物，这些抗体和蛋白质可以高度准确地预测5 年内诊断为CD 的患者，AUC 为0.76，在1 年内预测CD的AUC为0.87。此外，在儿童队列中，Starr等[28]发现一组包含5 种蛋白质作为候选生物标记物，可以区分IBD患儿和健康对照组，另一组包括12种蛋白质可以区分CD和UC患儿。

虽然CD患儿的生物标志物研究日益深入，目前尚没有一种生物标志物显示出对于CD 患儿早期诊断具有可靠的临床应用价值。而生物标志物联合检测显现出较高的特异度与灵敏度，预示其将在CD患儿早期筛查中提供重要帮助。

3 肠道微生物

3.1 肠道细菌

消化道微生物区系与CD 的发病机制之间存在复杂关系，肠道微生物失调是CD的一个潜在危险因素。一项研究中，新诊断的IBD 患儿与其健康同胞和健康对照组相比，微生物多样性显著不同，IBD组粪便样本中真杆菌属、乳酸杆菌属、肠杆菌属和梭状芽胞杆菌属减少，而链球菌属、普氏菌属和大肠杆菌属增加[29]。相比之下，一项针对CD患儿微生物群的纵向前瞻性单中心研究发现，与新诊断CD 患儿的相关细菌最多是梭杆菌属和副流感嗜血杆菌[30]。此外，Kowalska-Duplaga等[31]研究发现，未经治疗的CD患儿与健康对照组儿童粪便样本之间有11个属和17 个种存在显著差异，其中双歧杆菌、梭状芽孢杆菌、粪球菌、粪杆菌、芽殖菌和瘤胃球菌丰度减少。检测IBD 患儿的粪便微生物区系（FM）和黏膜样本微生物区系（MM）发现，IBD 组和对照组在FM 和MM的总体组成上有明显的分离，IBD的FM中细菌丰富度降低。在门水平上，IBD的FM中出现了变形杆菌和放线菌的丰度，而具有抗炎特性的种类（即瘤胃球菌）减少。与非炎症区和对照组样本相比，炎症区的梭杆菌占优势[32]。值得注意的是，一项调查中，多达40%CD患儿有口腔疾病，CD患儿舌样本中梭杆菌属和厚壁菌属减少，表明口腔细菌入侵肠道可能是观察到的部分生物失调的原因[33]。

由此可见，IBD 患儿粪便样本中最常见大肠杆菌、梭杆菌属、普雷沃菌属的丰度增加，而最常减少的菌群包括双歧杆菌属、梭状芽胞杆菌以及厚壁菌门的细菌（瘤胃球菌、真杆菌属、梭菌属）。由于多种因素，已发表研究的结果不一致且难以比较，尚不能确定导致CD相关炎症的细菌种类，但可以清楚地看出，与健康儿童相比，CD 患儿体内的微生物组在多样性和群落丰富度方面都有显著差异。因此，对CD患儿进行肠道生物群分析，可以将CD患儿与具有相似症状的患儿区分开来，可早期筛查CD 高危患儿。虽然这项检测不能取代内镜和组织学检查作为明确诊断的工具，但基于微生物多样性的分类可以作为筛查CD患儿的一种有效的补充技术[34]。

3.2 肠道真菌

在新诊断的、未接受治疗的CD患儿中进行的一项研究发现，与对照组相比，CD 患儿肠黏膜和粪便样本中增加的真菌类群都属于担子菌门，而减少的类群都属于子囊菌门，CD 患儿与对照组儿童比较，肠黏膜和粪便样本中真菌多样性无显著差异，而与CD肠黏膜相比，CD粪便中真菌多样性显著降低，表明CD患儿真菌菌群失调[35]。El Mouzan等[36]发现，真菌菌群失调在CD 患儿早期筛查中具有较高准确率，粪便真菌菌群失调的AUC高于黏膜（0.85±0.057对0.71±0.067，P＜0.001），提示粪便真菌菌群分析对于CD 早期筛查和诊断具有更高的准确性。虽然目前粪便真菌分析成本高，其临床应用受到限制，但鉴于真菌菌群在CD患儿识别中的重要作用，可发展一种非侵袭性的筛查试验，有利于CD患儿的早期筛查和诊断。

4 代谢组学

肠道微生物群变化会影响免疫系统和代谢途径，这些变化在IBD研究中很有意义，因为它们可能发展成为指示疾病发病的标志物或指导治疗的标志物。关于IBD 新诊断患儿的代谢组学报告显示，与健康对照组相比，UC 和CD 患儿的代谢物谱有显著不同。在血清样本中，与对照组相比，CD 患儿的氨基酸代谢、叶酸生物合成和信号通路受到干扰，鞘磷脂代谢途径也受到干扰。在粪便样本中发现CD 患儿一般表现为低水平或中等水平的代谢物，而这些代谢物在UC患儿中更为丰富。因此，粪便代谢物图谱比血清样本更好地鉴别CD和UC[37]。

在CD 患儿的脂质代谢组学研究中，Daniluk等[38]发现，与对照组相比，大部分重要代谢物属于磷脂类，在CD和UC中的表达下调，只有一种代谢物乳糖神经酰胺18:1/16:0（LacCer18:1/16:0）水平升高且能显著区分CD和UC，将LacCer18:1/16:0与其他炎症标志物相结合，AUC 显著增加，具有很高的特异度和灵敏度[38-39]。Filimoniuk 等[40]也发现，与对照组和UC组相比，CD组血清中的C16:0-LacCer浓度显著增加，差异最大，是CD诊断中的最高AUC，最高的特异度和灵敏度。此外，与对照组相比，两组IBD患者的C20:0-Cer和C18:1-Cer浓度均相应升高[40-41]。因此，LacCer18:1/16:0可能是一个对于CD患儿早期筛查有前景的生物标志物。

对IBD 患儿的尿液样本进行代谢组学分析，IBD 患儿的尿液代谢谱与健康对照组儿童显著不同，这些代谢差异包括中枢能量代谢、氨基酸、胆汁酸和肠道微生物代谢产物，其中IBD 患儿的焦谷氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸水平显著升高[42]。在新诊断IBD 患儿中，CD 组尿液中硫代吲哚、羟基吲哚硫酸盐、苯乙酰谷氨酰胺和唾液酸排泄量高于UC 组，而苏氨酸、丝氨酸、犬尿氨酸和次黄嘌呤排泄量低于UC组（P＜0.05）。根据尿丝氨酸/吲哚硫酸盐比值（AUC=0.972，P＜0.001）可很好地区分CD和UC[43]。

挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）是代谢组的挥发性组分，来源于肠道微生物群的持续代谢过程，这些化合物可在呼出气体、尿液和粪便中检测到，是一种新的有前途的筛查肠道炎症的生物标志物[44]。Patel等[45]分析了IBD患儿呼出的VOCs，其中21 个预先选择的VOCs 均能正确地区分IBD 组和健康对照组（P＜0.0001）。多因素logistic回归分析显示，3种特异性VOCs[1-辛烯、1-癸烯、（E）-2-壬烯]预测IBD 的准确性较好，AUC0.96（95%CI0.93～0.99），但CD和UC患儿之间VOCs无明显差异。Monasta等[46]通过检测VOCs中有前景的IBD 生物标志物（例如乙酸、丙烯、乙醛、乙腈和甲基乙基酮），也得出了类似结果，即在呼出的代谢物中可能存在IBD 患儿的独特呼吸印记。而另一项研究分析肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）/功能性腹痛（functional abdominal pain-not otherwise specified，FAP-NOS）患儿和IBD患儿的粪便VOCs 发现，儿童IBS/FAP-NOS 可通过粪便VOCs 与IBD 鉴别，且准确性较高(AUC 0.94，95%CI0.88～1，P＜0.00001)[47]。因此，VOCs分析是一种有潜在应用价值的筛查IBD患儿的非侵入性方法，然而，VOCs 分析还没有规范化的标准，离临床应用还很遥远。

综上所述，CD患儿早期筛查和诊断的研究已经取得一定进展，然而缺乏大样本、多中心的前瞻性研究，目前还没有足够可靠的非侵入性的指标可以在不进行内镜检查和组织活检的情况下确诊CD。未来，重点关注CD的生物发病和临床前阶段，对高危因素儿童进行早期筛查、随访，及早干预，以改变疾病病程，降低手术率和致残率，改善患儿生活质量。