苦豆子药材提取过程中成分的量变规律研究

吴永超,张天宇,孙 悦,齐六卫,闫 琰*

(1.沈阳伟嘉生物技术有限公司,沈阳 110027;2.沈阳药科大学,沈阳 110016)

苦豆子SophoraalopecuroidesL.是一种广泛分布在新疆、内蒙古、宁夏等地的多年生荒漠植物[1],具有耐旱[2]、耐盐碱[3-4]、适应性强的特点。苦豆子药材为豆科植物苦豆子SophoraalopecuroidesL. 的种子,其中含有生物碱、多糖、黄酮类、挥发油、有机酸等多种活性成分[5-6],具有清热燥湿,抗病毒[7-8]、抗菌[9-11]、止痛、抗炎[12]、杀虫[13]、抗肿瘤[14-15]、抗腹泻的作用。其中国内外学者研究比较多的成分为生物碱,已经鉴定出三十多种[16-17],主要含有金雀花碱[18]、槐定碱[19]、氧化苦参碱[20]、氧化槐果碱[21]、N-甲基野靛碱、苦参碱[22-23]、槐果碱[24]等多种生物碱成分,其种子中总生物碱含量为8.11%[25]。参考多篇文献整理发现苦豆子生物碱提取工艺一般采用酸水提取和乙醇超声提取,很少有报道研究直接水提工艺的生物碱成分变化规律[26-28]。

研究采用以水作为提取溶媒,系统研究不同浸泡时间、提取时间和提取次数对苦豆子药材7种生物碱成分的提取效率的影响,通过HPLC法测定不同提取液的7种生物碱成分(金雀花碱、槐定碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、N-甲基野靛碱、苦参碱、槐果碱)[29-31],揭示随浸泡时间、提取时间和提取次数变化苦豆子提取液中7种生物碱成分的量变规律,为更加有效的利用苦豆子提供数据支撑。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1260型高效液相色谱仪、DAD检测器(美国Agilent公司);PS-40AD型数控超声波清洗器(深圳市科洁超声科技有限公司);HH-4B数显恒温水浴锅(常州荣华仪器制造有限公司);ME55型电子天平(METTLER TOLEDO公司)。

1.2 试药 对照品分别为苦参碱(110805-202010,纯度为98.7%)、氧化苦参碱(110780-202210,纯度为92.8%)、槐果碱(112052-202001,纯度为91.8%)和氧化槐果碱(111652-202202,纯度为93.1%)购自中国药品生物制品检定所,金雀花碱(wkq22062209,纯度≥98%)和N-甲基野靛碱(wkq23013007,纯度≥98%)购自四川省维克奇生物科技有限公司,槐定碱(21061703,纯度98.56%)购自成都格利普生物科技有限公司;乙腈、乙酸铵为色谱纯;水为超纯水;其他试剂均为分析纯;苦豆子购于亳州星嘉中药原料有限公司,经鉴定为苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)的干燥种子。

2 方法和结果

2.1 高效液相色谱法

2.1.1 色谱条件 色谱柱纳谱分析ChromCore BRC18(150 mm×4.6 mm,3 μm);以乙腈(A)-0.1%乙酸铵(B)为流动相,洗脱梯度(0～5 min,95%B;5～20 min,70%B);检测波长220 nm;流速为0.8 mL/min;进样量10 μL;柱温30 ℃;理论塔板数按氧化槐果碱计,应不低于4000。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品金雀花碱0.00628 g、槐定碱0.00730 g、氧化苦参碱0.00617 g、氧化槐果碱0.00553 g、N-甲基野靛碱0.00712 g、苦参碱0.00690 g、槐果碱0.00565 g,置于25 mL容量瓶中,用70%乙醇溶解并定容至刻度,制备成浓度为金雀花碱0.2512 mg/mL、槐定碱0.2920 mg/mL、氧化苦参碱0.2468 mg/mL、氧化槐果碱0.2212 mg/mL、N-甲基野靛碱0.2848 mg/mL、苦参碱0.2760 mg/mL、槐果碱0.2260 mg/mL的混合对照品溶液,备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密量取苦豆子提取液20 mL,置于蒸发皿中水浴蒸干,残渣加70%乙醇溶解,定容到2 mL量瓶中,摇匀,过滤,即得。

2.1.4 线性关系考察 分别精密量取“2.1.2”项下制备的混合对照品溶液200 μL、300 μL、500 μL、1 mL、2 mL、5 mL、7.5 mL,置于10 mL容量瓶中,加70%乙醇稀释至刻度,摇匀,用0.22 μm微孔滤膜过滤,即得。按“2.1.1”项下色谱条件进行测定,以每种生物碱对照品浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,得到7种生物碱的线性回归方程、r值以及线性范围,实验结果见表1。

表1 7种生物碱的线性方程、相关系数(r)和线性范围Tab 1 Linear equations,correlation coefficients(r)and linear ranges of seven kinds of alkaloids

2.1.5 精密度试验 按“2. 1.1” 项下色谱条件,进样10 μL,重复进样6次,分别计算7种生物碱的峰面积的RSD值,结果见表2。

表2 7种生物碱精密度、重复性、稳定性和加样回收率实验结果(n=6)Tab 2 Experimental result of precision,repeatability,stability and average recovery of 7 alkaloids. (n=6)

2.1.6 重复性试验 精密称取6份同一批样品,按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液,用0.22 μm的有机系微孔滤膜过滤至进样瓶中,进样10 μL,分别计算7种生物碱的峰面积的RSD值,结果见表2。

2.1.7 稳定性试验 取“2.1.6重复性试验”项下供试品①,按照“2.1.1”项下色谱条件分别在 0、2、4、6、8、10、12、24 h进样10 μL,分别计算7种生物碱峰面积的RSD值,实验结果见表2。

2.1.8 加样回收率实验 分别精密量取已知7种生物碱含量的样品溶液6份,每份10 ml,每份样品溶液分别加入金雀花碱、槐定碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、N-甲基野靛碱、苦参碱、槐果碱,精密称定,加入的量与已知样品溶液中所含成分比例约为1∶1,混合均匀,按“2.1.3”项下供试品溶液的制备方法制备供试液,0.22 μm微孔滤膜过滤,按“2.1.1”项下色谱条件进样测定,分别记录峰面积,并计算回收率,加样回收率实验结果见表2。

2.2 水提工艺研究

2.2.1 不同浸泡时间考察 精密称取100 g苦豆子药材7份,每份加入8倍量的水,分别浸泡1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h,取样,300目滤布过滤,得到不同浸泡时间的提取液,平行制备3份,分别量取并记录提取液体积。

2.2.2 不同提取时间考察 取苦豆子200 g,精密称定,加入8倍量水,浸泡4小时,分别提取1、2、3、4 h,300目滤布过滤,得到不同提取时间的苦豆子药材提取液,平行制备3份,分别量取并记录提取液体积。

2.2.3 不同提取次数考察 取苦豆子200 g,精密称定,加入8倍量水,浸泡4小时,分别提取1、2、3、4次,每次提取2小时,300目滤布过滤,得不同提取次数的苦豆子提取液,平行制备3份,分别量取并记录提取液体积。

2.3 结果 参照“3.1.3供试品溶液的制备”“3.1.1色谱条件”方法制备“3.2提取条件研究”项下所有提取液供试品溶液并检测提取液中的金雀花碱、槐定碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、N-甲基野靛碱、苦参碱、槐果碱的含量,苦豆子提取液供试品溶液高效液相色谱图如图1所示,不同浸泡时间、提取时间、提取次数的7种生物碱的结果如图2所示。

注:1.金雀花碱;2.槐定碱;3.氧化苦参碱;4.氧化槐果碱;5.N-甲基野靛碱;6.苦参碱;7.槐果碱。图1 苦豆子混合对照品溶液(A)和供试品溶液(B)的高效液相色谱图Fig 1 HPLC Chromatograms of mix standard solution(A)and test solution(B)of Sophora alopecuroides L

图2 不同浸泡时间(A)、提取时间(B)和提取次数(C)苦豆子药材水提的7种生物碱成分趋势图Fig 2 Trend of 7 alkaloid components in water extraction of Sophora alopecuroides with different soaking time (A), extraction time (B) and extraction times (C)

如图2A所示,浸泡时间为1～6 h,随着浸泡时间的增加,水提液中金雀花碱、槐定碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、N-甲基野靛碱、苦参碱只有少量增加,氧化槐果碱、氧化苦参碱、槐定碱增加明显,且在浸泡3 h达到最高点,3 h之后,随着时间的增加,氧化槐果碱、氧化苦参碱、槐定碱均开始下降明显,说明浸泡时间不能超过3 h;如图2B 所示,苦豆子药材提取时间为1～4 h,随着提取时间延长,金雀花碱基本保持不变,除金雀花碱外其他6种生物碱成分均逐步增加,在提取3 h到达顶点,3 h之后开始下降,说明每次提取时间不能超过3 h;如图2C所示,提取次数为 1～4次时,随着提取次数增加,苦豆子中被提出的7种生物碱的量越多,但增长的趋势在逐步减缓。

3 讨 论

我国的苦豆子总产量占世界的62%[32],广泛分布于我国的沙漠地区,是生长于沙土上耐盐的多年生草本根茎地下芽植物,具有较强的生命力与繁殖力,植株特别是果实味极苦,青绿状态下野生动物及畜禽均不采食,因而自然环境中储备量较大,经适口性改良后,可用于畜禽预防、治疗使用[33]。文中检测的苦豆子中7种生物碱成分,属于喹诺里西啶生物碱类成分,具有抗病毒、抗炎、抗溃疡、抗腹泻等功效[33-34],文献报道,可明显改善畜禽养殖过程中的仔猪、羔羊腹泻。

研究采用高效液相色谱法,以水作为提取溶媒,研究不同浸泡时间、不同提取时间、不同提取次数对苦豆子药材水提液中7种生物碱成分的量变规律,发现浸泡时间对氧化槐果碱、氧化苦参碱、槐定碱影响明显,且浸泡时间不宜超过3 h;提取时间对除金雀花碱外的其他6种生物碱的量有增加,且提取超过3 h后开始下降;随着提取次数的增加,提取出的7种生物碱的量也在逐步增加。

实验结果显示,苦豆子中生物碱类成分的含量,对提取工艺的各个因素比较敏感,需精确控制提取条件,可为苦豆子生物碱成分的利用和实际生产中的苦豆子水提工艺提供科学依据,同时对于其他含有生物碱类成分的药材,也具备一定参考价值。在实际应用当中,需综合考虑生物碱类成分含量、能耗损失等因素,确定具体生产条件。