猪ECR1-like免疫黏附功能对PAMs捕获GFP-E. coli的影响

张峥，凌小雅，范阔海，孙娜，孙盼盼，孙耀贵，李宏全，尹伟

猪ECR1-like免疫黏附功能对PAMs捕获GFP-的影响

1中兽医药现代化山西省重点实验室/山西农业大学动物医学学院，山西太谷 030801；2中兽医药现代化山西省重点实验室/山西农业大学动物实验中心，山西太谷 030801

【目的】探讨猪红细胞类Ⅰ型补体受体（erythrocyte complement receptor type 1-like, ECR1-like）免疫黏附功能是否能够促进猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages, PAMs）捕获致敏基因工程菌（GFP-, GFP），以期阐释猪红细胞免疫的分子机理及红细胞免疫在机体先天免疫中的作用。【方法】利用流式细胞术、菌落平板计数及RT-PCR技术检测PAMs捕获的GFP-的水平，分析猪ECR1-like免疫黏附对PAMs捕获GFP-的影响；运用流式细胞术、细胞免疫荧光化学技术检测猪ECR1-like免疫黏附的致敏GFP-被PAMs移除后，猪红细胞免疫黏附功能的变化及猪ECR1-like数量的变化。【结果】流式细胞术检测发现猪红细胞黏附组较空白对照组中的PAMs平均荧光强度显著提高（＜0.001），且PAMs阳性细胞率也显著提高（＜0.05）；菌落涂板计数发现红细胞黏附组较空白对照组PAMs捕获GFP-情况显著增强（＜0.05）；RT-PCR检测发现，红细胞黏附组PAMs中GFP-的相对数量显著高于空白对照组（＜0.01）；进一步阻断猪红细胞表面的CR1-like，流式细胞术检测发现PAMs平均荧光强度降低至256 301.56±9 208.85（＜0.001），PAMs阳性细胞率降低至（88.32±0.92）%（＞0.05），菌落平板计数发现PAMs捕获GFP-情况减弱为（136 666±8 818）CFU/mL（＜0.05），RT-PCR检测发现PAMs中GFP-的相对数量显著减少（＜0.01）；利用细胞流动循环互作技术发现：猪红细胞免疫黏附致敏GFP-的平均荧光强度由循环前2 892.18±47.76降至2 407.43±141.78（＜0.05），阳性细胞率由循环前（20.58±0.36）%降至（17.39±0.23）%（＜0.001），黏附水平显著低于循环前，与此同时，间接免疫荧光试验结果显示：试验组循环后猪ECR1-like平均荧光强度由循环前344.33±37.92降低至291.56±11.99（＜0.05），阳性细胞率由（30.20±1.24）%减少至（28.27±0.64）%（＜0.05）。【结论】猪ECR1-like通过免疫黏附功能促进了PAMs对致敏GFP-的捕获。PAMs移除猪红细胞表面黏附的致敏GFP-后，猪红细胞的活性CR1-like减少，免疫黏附功能下降。

猪；红细胞；猪肺泡巨噬细胞；类Ⅰ型补体受体；免疫黏附

0 引言

【研究意义】自1981年SIEGEL等首次提出“红细胞免疫系统”概念，并发现红细胞具有多种免疫功能[1]。红细胞表面存在I型补体受体（erythrocyte complement receptor type 1, ECR1），且在ECR1的介导下，能够黏附经补体活性成分C3b致敏的病原体或免疫复合物（immune complex, IC），通过血液循环至肝脏、脾脏，最终由吞噬细胞清除[2]。红细胞类I型补体受体（erythrocyte complement receptor I-like，ECR1-like）是猪红细胞膜表面的天然免疫活性分子，其被证实是C3b调理免疫复合物的免疫黏附受体[3-5]。研究表明，猪红细胞能够通过CR1-like介导的免疫黏附功能，从而结合经血清致敏的大肠杆菌[6-7]。ECR1-like在清除IC的过程中同样发挥着重要作用，因此，深入探究ECR1-like介导清除IC的过程及分子机制对于维持机体内环境稳态、免疫平衡及机体健康具有重要意义。【前人研究进展】红细胞CR1的免疫黏附功能在相关疾病发生发展及转归中发挥重要作用。研究表明，红细胞免疫黏附功能与细菌[8-10]、病毒[11-13]、寄生虫[14]等病原体的清除具有相关性，且红细胞表面的CR1分子在机体清除内源性IC的过程中同样发挥着重要作用[15-18]。REINAGEL等[19]将补体致敏杂聚物（heterochain polymer, HP）和噬菌体φX174作为模式IC进行研究，发现人红细胞结合IC后与小鼠巨噬细胞孵育，在小鼠巨噬细胞内能检测到IC的存在，表明红细胞结合的IC可由小鼠巨噬细胞吞噬内化，同时伴随有红细胞CR1的损失，通过ELISA检测到CR1出现在巨噬细胞内部，CR1可能同IC一起被巨噬细胞吞噬内化。HEPBURN等[20]建立了单层巨噬细胞的平行板流动系统用于检测体内血流剪切力条件下IC从红细胞表面的转移，Fc受体（Fc receptor, FcR）和补体受体（complement receptor, CR）的阻断抑制了IC向巨噬细胞的转移，其中，FcγRIIa的阻断影响最大，FcR和CR在巨噬细胞移除红细胞表面IC的过程中发挥协同作用，共阻断抑制作用最明显。本课题组前期经研究发现猪红细胞上存在CR1-like[3]。且证明其是通过EPB41分子锚合在红细胞膜表面[21-22]，在体外条件下，经酵母杂交体系，研究证明了猪红细胞CR1-like活性片段能够与C3b相互结合[5]。PAMs能通过CR1-like竞争性结合猪红细胞表面黏附的GFP-，且猪红细胞形态不受影响。但是，猪ECR1-like水平显著降低[23-24]。【本研究切入点】本试验通过模拟血液循环的自然生理状态，构建猪红细胞与PAMs动态互作循环系统，针对PAMs捕获GFP-的量和循环前后的平均荧光强度和阳性细胞率进行分析。【拟解决的关键问题】探讨ECR1-like介导PAMs移除表面GFP-过程中PAMs捕获效率是否提高？猪红细胞免疫黏附水平是否变化？等关键问题，深入探究红细胞CR1清除IC的过程及分子机制，以期为调控红细胞免疫应用于动物临床研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物及菌株

试验于2020年10月至2022年5月进行。试验地点为山西农业大学中兽医药现代化山西省重点实验室。试验所需健康40日龄长白仔猪，体重（20±2）kg，购自太谷县冠农农牧科技有限公司。表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌（GFP-）由山西农业大学中兽医药现代化山西省重点实验室制备保存。

1.2 试验试剂

鼠抗猪CR1-like McAb（IgG1亚型）为山西农业大学中兽医药现代化山西省重点实验室制备（专利：ZL201410308534.0）；Mouse IgG1 Isotype Control购自北京博奥森生物技术有限公司；羊抗小鼠IgG- CoraLite 488购自武汉三鹰生物技术有限公司。

RPMI-1640培养基，购自美国Gibico公司；DMSO、青链霉素混合液、多聚-L-赖氨酸（15—30万）、Hank’s缓冲液，均购自索莱宝科技有限公司；胎牛血清，购自以色列Biolnd公司；胰蛋白胨、酵母提取物，购自上海生工生物工程有限公司；猪外周血红细胞分离液试剂盒购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、Trizol、SYBR Premix Ex Taq TM II均购自宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.3 猪ECR1-like活性影响PAMs捕获GFP-E.coli的检测

1.3.1 流式细胞术检测PAMs阳性细胞率及平均荧光强度 参照文献[25-27]的方法制备猪红细胞悬液、猪血清和致敏GFP-悬液，构建猪红细胞与PAMs动态互作体系按文献[28]方法操作。分4组进行检测，即空白对照组、红细胞黏附组、ECR1-like阻断组和同型对照组，分别记为A、B、C、D组。

A组：取4 mL致敏GFP-悬液与4 mL Hank’s缓冲液直接孵育，结束后加入8 mL Hank’s缓冲液，将致敏GFP-悬液置于流动相瓶中，按照文献[27]方法使菌液循环流动，待充满整个小室后开始计时，60 min后进行后续检测；B组：取Hank’s缓冲液80 μL与4 mL猪红细胞悬液混匀于37 ℃孵育2 h，孵育结束后1 500 r/min，5 min离心两次，后续方法同上；C组：取猪CR1-like McAb 80 μL与4 mL猪红细胞悬液混匀于37 ℃孵育2 h，孵育结束后1 500 r/min，5 min离心两次，后续方法同上；D组：以IgG1同型抗体替代C组的猪CR1-like McAb，其余操作同C组。

取上述各组循环后的PAMs载玻片，流式细胞仪检测各组PAMs阳性细胞率及平均荧光强度。

1.3.2 菌落平板计数法检测PAMs裂解液中GFP-数量 取上述4组循环后的PAMs载玻片，PBS洗涤3次，加1 mL 0.3%的TritonX-100裂解10 min。收集PAMs及裂解产物，稀释100倍后均匀涂布15 μL于LB固体培养基（含100 μg·mL-1Amp），37℃倒置培养16 h，计数各组GFP-的CFU。按式（1）分别计算各组PAMs捕获GFP-的情况。

PAMs吞噬情况（CFU/mL）=

1.3.3 RT-PCR检测PAMs中GFPmRNA相对表达量 取上述各组循环后的PAMs载玻片，PBS洗涤3次，加入1 mL Trizol，提取RNA，经TaKaRa SYBR PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒反转录为cDNA，引物的设计参考NCBI数据库进行设计（表1），以GAPDH作内参，实时荧光定量PCR检测GFP-基因的变化。

表1 引物序列

1.4 PAMs移除致敏GFP-E.coli后猪红细胞免疫黏附功能的检测

1.4.1 流式细胞术检测猪红细胞免疫黏附GFP-水平 分3组进行检测，即空白对照组、试验组、阴性对照组，分别记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3组。

（Ⅰ）空白对照组：取未复苏PAMs的空白洁净载玻片，盖上平行板流动小室，以黏附有致敏GFP-的猪红细胞悬液16 mL为流动相，建立循环流动体系。启动蠕动泵，待流动相充满整个平行板流动小室后开始计时，60 min进行后续检测；（Ⅱ）试验组：取复苏有PAMs的载玻片，盖上平行板流动小室，以黏附有致敏GFP-的猪红细胞悬液16 mL为流动相，其余操作同（Ⅰ）组；（Ⅲ）阴性对照组：取复苏有PAMs的载玻片，盖上平行板流动小室，以猪红细胞悬液16 mL为流动相，其余操作同（Ⅰ）组。

取各组0 min时的流动相红细胞悬液300 μL，取各组60 min时的流动相红细胞，按照1.3的方法再次黏附致敏GFP-，用流式细胞仪检测猪红细胞平均荧光强度及阳性细胞率，两次样的数值分别代表PAMs移除致敏GFP-前后猪红细胞的免疫黏附功能。

1.4.2 流式细胞术检测猪ECR1-like数量 试验分为6组，分别记为a、b、c、d、e、f组。

a组：取循环前的猪红细胞悬液200 μL，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入0.5% BSA 200 μL重悬，于37℃孵育30 min，1 500 r/min、5 min离心洗涤2次，以200 μL Hank’s重悬。按1﹕50比例加入猪CR1-like McAb，37℃孵育1 h后，用Hank’s缓冲液1 500 r/min、5 min离心洗涤2次，以200 μL Hank’s重悬。再向其中加入2 μL羊抗小鼠IgG-CoraLite 488，37 ℃避光孵育1 h，间歇振荡。孵育完毕，用Hank’s缓冲液1 500 r/min、5 min离心洗涤2次，重悬后用流式细胞仪检测其平均荧光强度。

b组：取1.4.1中I组60 min后的猪红细胞悬液200 μL，其余操作同a组。

c组：取1.4.1中Ⅱ组60 min后的猪红细胞悬液200 μL，其余操作同a组。

d组：取1.4.1中III组60 min后的猪红细胞悬液200 μL，其余操作同a组。

e组：取循环前的猪红细胞悬液200 μL，以小鼠同型抗体IgG1代替CR1-like McAb进行处理，其余操作同a组。

f组：取循环前的猪红细胞悬液200 μL，Hank’s缓冲液代替抗体进行处理，其余操作同a组。

2 结果

2.1 猪ECR1-like增强PAMs捕获GFP-E.coli后的平均荧光强度及阳性细胞率。

收集各组循环后的PAMs，用流式细胞仪分析PAMs阳性细胞率及平均荧光强度并进行统计（图1，表2）。

各组平均荧光强度经单因素方差分析可见：与A组相比，B组PAMs平均荧光强度极显著增高（＜0.001），C组PAMs平均荧光强度较B组极显著降低（＜0.001），D组PAMs平均荧光强度与B组相比无显著差异（＞0.05）；各组阳性细胞率经单因素方差分析可见：与A组相比，B组PAMs阳性细胞率显著增高（＜0.05），C、D组PAMs阳性细胞率与B组相比均无显著差异（＞0.05，图2）。

2.2 猪ECR1-like增强PAMs捕获GFP-E. coli的数量

收集各组循环后的PAMs载玻片，收集PAMs并裂解，涂布于LB固体培养基（含Amp），根据培养结果计算得出各组PAMs捕获致敏GFP-的情况（图3，表3）。将计数结果进行单因素方差分析可见：与A组相比，B组PAMs在1 h内对GFP-的捕获数量显著增多（＜0.05），C组PAMs捕获GFP-较B组显著减少（＜0.05），D组PAMs捕获GFP-数与B组相比无显著差异（＞0.05，图4）。

表2 阻断猪ECR1-like活性对PAMs阳性细胞率及平均荧光强度的影响

A为空白对照组；B为红细胞黏附组；C为ECR1-like阻断组；D为同型对照组。图2—5同

图2 PAMs阳性细胞率及平均荧光强度单因素方差分析

图3 阻断猪ECR1-like活性后PAMs捕获GFP-E. coli的平板涂布情况

表3 阻断猪ECR1-like活性对PAMs捕获GFP-E. coli菌落计数结果的影响

图4 PAMs捕获GFP-E. coli情况单因素方差分析

2.3 猪ECR1-like增强PAMs中GFP-E coliβ-D- galactosidase mRNA相对表达量

RT-PCR检测大肠杆菌中mRNA相对表达量，从而反映GFP-的相对数量，进行单因素方差分析。与A组相比，B组PAMs中GFP-的相对数量极显著升高（＜0.01），与B组相比，C组PAMs中GFP-的相对数量极显著降低（＜0.01），D组中GFP-的相对数量无显著变化（＞0.05，图5）。

图5 PAMs捕获GFP-E coli相对数量单因素方差分析

2.4 PAMs移除致敏GFP-E. coli后猪红细胞免疫黏附功能下降

流式细胞技术检测各组循环前后猪红细胞的免疫黏附GFP-的功能（图6），以猪红细胞循环前免疫黏附及循环后重新黏附GFP-的阳性细胞率和平均荧光强度作为评判（表4）。

将平均荧光强度数据进行T检验分析，Ⅱ组PAMs移除猪红细胞表面致敏GFP-后免疫黏附平均荧光强度较循环前免疫黏附平均荧光值显著降低（＜0.05）；Ⅰ、Ⅲ组循环前、后猪红细胞免疫黏附平均荧光值无显著变化（＞0.05，图7）。

将阳性细胞率数据进行T检验分析，Ⅱ组PAMs移除猪红细胞表面致敏GFP-后猪红细胞免疫黏附阳性细胞率较循环前猪红细胞的免疫黏附阳性细胞率极显著降低（＜0.001）；Ⅰ、Ⅲ组循环前、后猪红细胞免疫黏附阳性细胞率无显著变化（＞0.05，图8）。

表4 PAMs移除致敏GFP-E. coli前后猪红细胞免疫黏附阳性细胞率及平均荧光强度检测

Ⅰ为空白对照组，Ⅱ为试验组，Ⅲ为阴性对照组。图7和8同

2.5 PAMs移除致敏GFP-E. coli后导致猪ECR1-like数量减少

细胞免疫荧光结合流式细胞术对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组处理后的猪ECR1-like的数量变化进行检测（图9），以猪红细胞阳性细胞率及平均荧光强度作为评判（表5），进行单因素方差分析（图10）。

b组与a组平均荧光强度相比无显著差异（＞0.05），c组较a组平均荧光强度相比显著降低（＜0.05），d组与a组相比无显著差异（＞0.05）；e组极显著低于a、b、c、d组的平均荧光强度（＜0.01），f组极显著低于a、b、c、d、e组的平均荧光强度（＜0.01）。

b组与a组阳性细胞率相比无显著差异（＞0.05），c组较a组阳性细胞率相比显著降低（＜0.05），d组与a组阳性细胞率相比无显著差异（＞0.05）；e组极显著低于a、b、c、d组的阳性细胞率（＜0.01），f组为空白对照，无阳性细胞。

图7 PAMs移除致敏GFP-E. coli前后猪红细胞免疫黏附水平（平均荧光强度）的比较

图8 PAMs移除致敏GFP-E. coli前后猪红细胞免疫黏附水平（阳性细胞率）的比较

表5 PAMs移除致敏GFP-E. coli前后猪ECR1-like阳性细胞率及平均荧光强度检测

3 讨论

3.1 猪ECR1-like促进PAMs捕获GFP-E. coli

本试验以致敏GFP-作为模式IC观察猪ECR1-like免疫黏附在PAMs清除IC过程中的作用，发现猪ECR1-like免疫黏附能够促进PAMs对致敏GFP-的捕获。试验运用3种不同技术对PAMs捕获GFP-的量进行了检测，首先，运用流式细胞术检测了PAMs的平均荧光强度和阳性细胞率，平均荧光强度越高，表明PAMs捕获的GFP-越多，结果显示，在红细胞介入的试验组中PAMs平均荧光强度显著高于没有红细胞介入的等量的单纯的GFP-空白对照组，表明红细胞在该体系中能够促进PAMs对GFP-的捕获，进而预先以CR1-like单抗阻断红细胞表面的CR1-like位点，再将处理过的红细胞以上述方法操作试验，猪红细胞对PAMs捕获GFP-的促进作用减弱，与试验组相比PAMs平均荧光强度显著降低，这表明猪红细胞能够促进PAMs对GFP-的清除，发挥功能的分子基础与CR1-like相关。收集各组试验后的PAMs裂解后进行菌落涂板计数能够直观地评估PAMs捕获GFP-的情况，将计数结果进行统计分析，试验组比空白对照组细菌数显著增多，ECR1-like阻断组比试验组细菌数显著减少，与空白对照组细菌数无差异，这样的趋势与流式细胞术检测结果一致，并展现了ECR1-like在PAMs清除GFP-过程中的关键作用。之后，运用RT-PCR技术对PAMs捕获GFP-的情况进行检测，统计分析得到了和前两种技术结果相同的趋势。而且，ECR1-like的阻断组除了阻断对照作用，还能够作为无免疫黏附功能的粒子介入的阴性对照，即使猪红细胞丧失了免疫黏附功能，又能保持和猪红细胞相同的细胞特性，试验对照更加完善，更加提高了试验结果的客观性与准确性。前期试验结果表明，CR1-like是猪红细胞免疫黏附重要的分子基础，CR1-like单抗对猪红细胞免疫黏附具有阻断作用[29]。结合本试验3种技术得到的结果分析得出：猪红细胞免疫黏附能够促进PAMs对致敏GFP-的吞噬清除，CR1-like是发挥促进功能的分子基础。也就是说，猪ECR1-like免疫黏附在吞噬细胞清除IC的过程中起到了正面的、积极的促进作用。

a组为正常对照组，b组为Ⅰ处理组，c组为Ⅱ处理组，d组为Ⅲ处理组，e组为同型对照组，f组为空白细胞组，图10同

图10 PAMs移除致敏GFP-E. coli后猪ECR1-like数量的比较

这与LI等的研究结果一致，LI等[9, 29]以CR1＋转基因小鼠红细胞和野生型小鼠红细胞为研究对象对小鼠清除肺炎链球菌的效率进行研究，将等量的FITC标记的肺炎链球菌与红细胞孵育，并加入小鼠巨噬细胞系J774A.1中以评估肺炎链球菌向巨噬细胞的转移，结果发现，30 min后，与野生型小鼠红细胞相比，从表达CR1的小鼠红细胞转移至巨噬细胞的肺炎链球菌显著增多。然而2019年BREKKE等[8]的研究发现，红细胞CR1表达量越高，结合大肠杆菌数越多，人全血中白细胞（包括粒细胞和单核细胞）的吞噬能力下降；在将CR1阻断后，血浆游离菌的数量增多，白细胞的吞噬能力增强，推测其原因可能是因为大肠杆菌的游离增加了白细胞对其的可得到性。本试验结果与此结果的差异可能因不同病原体而异，也可能是由于在吞噬系统中单核细胞和巨噬细胞等不同吞噬细胞的角色和职能有所差异。

由于1 h的时间限制，观测到的猪红细胞能够促进PAMs对红细胞表面致敏的GFP-的捕获结果可以解释为两种情况，一种是猪红细胞的介入能够加快肺泡巨噬细胞对GFP-的获取，在单位时间内PAMs对IC的捕获增多；经过对PAMs阳性细胞率的统计比较，也可能是红细胞的介入增加了活性PAMs的数量，使得之前不能及时捕获IC的PAMs能够快速结合IC。另外，从显微镜记录的过程来看，PAMs在1 h内便可将部分GFP-吞噬清除，因此，试验条件需进一步优化以得到更加准确的结果。猪红细胞表面CR1-like被阻断后，对PAMs捕获IC的促进功能未完全消失，可能在PAMs清除猪红细胞表面IC的过程中除了CR1-like还有其他分子发挥作用。前期实验室的研究也证明了PAMs上存在有CR1-like，且PAMs表面CR1-like相对数量是猪红细胞的4—5倍甚至更多[26]，IC从红细胞到巨噬细胞上的转移是PAMs上FcR和CR1-like共同作用的结果，两个受体可产生协同作用[24]。从本试验的结果中也不难看出，PAMs对GFP-的黏附及吞噬功能强于猪红细胞，CR1-like相对数量越多，免疫黏附功能越强，IC的转移是CR1-like多的细胞从CR1-like少的细胞的竞争性结合，无论是阻断PAMs表面的CR1-like或是阻断猪红细胞表面的CR1-like，PAMs移除GFP-的量都会减少，这表明CR1-like在其中起到了重要的承接作用，而且，CR1-like与CR1-like独特承接介导的IC转移可能更快。

3.2 PAMs移除致敏GFP-E. coli后猪红细胞免疫黏附功能下降

本试验利用流式细胞技术结合免疫荧光细胞化学技术初步探究了PAMs清除猪红细胞表面IC后猪红细胞免疫黏附功能的变化，将流动小室循环后的猪红细胞再次进行免疫黏附致敏GFP-，用流式细胞仪检测其荧光强度，与循环前猪红细胞免疫黏附致敏GFP-的荧光强度进行T检验得出，PAMs清除猪红细胞表面GFP-后，猪红细胞免疫黏附水平下降，而CR1-like是猪红细胞发挥免疫黏附功能重要的分子基础，其数量也呈下降趋势。试验设置了两个对照组，空白对照组为无PAMs组，循环体系中只有免疫黏附致敏GFP-的猪红细胞，该组的设立避免了平行板流动小室物理循环体系对试验结果的干扰；阴性对照组为PAMs与猪红细胞循环组，其中的红细胞没有黏附致敏GFP-，结果证明自然情况下正常猪红细胞不会与PAMs互作而导致猪红细胞免疫黏附水平及CR1-like的变化。结合以上分析说明，PAMs移除猪红细胞表面GFP-这一生物学过程导致了猪红细胞免疫黏附水平的下降和ECR1-like的减少。这与前人研究结果一致[30-32]。但是由于本试验CR1-like McAb的限制，并不能完全下结论为猪红细胞表面CR1-like在此过程中丢失，也可能由于IC清除过程中对CR1-like位点的占用或CR1-like变构所致，其具体机制还待进一步试验探究。

4 结论

在体外流动状态下，猪红细胞类Ⅰ型补体受体通过其免疫黏附功能能够促进猪肺泡巨噬细胞对致敏GFP-的捕获。猪肺泡巨噬细胞移除猪红细胞表面黏附的致敏GFP-后，猪红细胞的活性CR1-like减少，免疫黏附功能下降。

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Effect of Porcine ECR1-Like Immune Adhesion on PAMs Capturing GFP-

ZHANG Zheng1, LING XiaoYa1, FAN KuoHai2, SUN Na1, SUN PanPan1, SUN YaoGui1, LI HongQuan1, YIN Wei

1Shanxi Key Laboratory for Modernization of TCVM/College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2Shanxi Key Laboratory for Modernization of TCVM/Animal Experimental Center, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi

【Objective】The aim of this study was to investigate whether the immune adherence function of porcine erythrocyte complement receptor type 1-like (ECR1-like) could promote porcine alveolar macrophages (PAMs) to capture sensitized genetic engineering bacteria GFP-, in order to explain the molecular mechanism of porcine erythrocyte immunity and its role in innate immunity. 【Method】The level of GFP-captured by PAMs was detected by flow cytometry, colony plate counting and RT-PCR, and the effect of porcine ECR1-like immune adherence on the capture of GFP-by PAMs was analyzed. Flow cytometry and cellular immunofluorescence technique were used to detect the changes of immune adherence function of porcine erythrocytes, and the number of porcine ECR1-like after the sensitized GFP-with ECR1-like immune adherence was removed by PAMs. 【Result】Flow cytometry showed that the average fluorescence intensity of PAMs in porcine erythrocyte adhesion group was significantly higher than that in blank control group (＜0.001), while the positive rate of PAMs cells in porcine erythrocyte adhesion group was significantly higher than that in blank control group (＜0.05). Colony smear count showed that the capture of GFP-by PAMs in erythrocyte adhesion group was significantly higher than that in blank control group (＜0.05). RT-PCR showed that the relative quantity of GFP-in PAMs of erythrocyte adhesion group was significantly higher than that of blank control group (＜0.01). Further blocking CR1-like on the surface of porcine erythrocyte, flow cytometry showed that the average fluorescence intensity of PAMs decreased to 256 301.56±9 208.85 (＜0.001), and the positive cell rate of PAMs decreased to (88.32±0.92)% (＞0.05). Colony count showed that the capture of GFP-in PAMs decreased to (136 666±8 818) CFU/ml (＜0.05), and RT-PCR showed that the relative quantity of GFP-in PAMs decreased significantly (＜0.01). Using cell flow and circulation interaction technique, it was found that the average fluorescence intensity of GFP-sensitized by porcine erythrocyte immune adherence decreased from 2 892.18±47.76 before circulation to 2 407.43±141.78 (＜0.05), and the positive cell rate decreased from (20.58±0.36)% before circulation to (17.39±0.23)% (＜0.05). The adhesion level was significantly lower than that before circulation. Meanwhile, the results of indirect immunofluorescence test showed that the average fluorescence intensity of porcine ECR1-like decreased from 344.33±37.92 before to 291.56±11.99 (＜0.05), and the positive cell rate decreased from (30.20±1.24)% before to (28.27±0.64)% (＜0.05). 【Conclusion】Porcine ECR1-like promoted the capture of sensitized GFP-by PAMs through its immune adhesion function. After PAMs removed sensitized GFP-adhered to the surface of porcine erythrocyte, the activity of CR1-like of porcine erythrocyte decreased, and the immune adhesion function decreased too.

porcine; erythrocyte; PAMs; CR1-like; immune adherence

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.19.016

2022-11-26；

2023-08-04

山西省自然科学基金面上项目（20210302123407）、山西省科技创新人才团队专项（202204051001021）、山西省高等学校科技创新项目（2019L0364）、山西农业大学博士科研启动项目（2021BQ77）、中兽医药现代化重点实验室建设项目（202104010910015）

张峥，E-mail：zhangzhengjiayou@163.com。通信作者尹伟，E-mail：dkyyinwei@126.com

（责任编辑 林鉴非）