NLRP3炎症小体：化学性肝损伤防治靶点

董 颖，李纪丰，张宇欣，郭浩林，白 婷，杨 勇

（大连大学慢性病研究中心大连市重点实验室，辽宁 大连 116622）

肝是人体腹腔中最大的新陈代谢器官，可分解或排出许多内源性和外源性非营养物质以维持体内平衡，这被称为“解毒功能”。肝也是最初接触到各种类型药物、乙醇和化学毒物等外源性物质的器官，很容易导致急性或慢性肝损伤。

按病因肝损伤通常可分为化学性肝损伤（chemical liver injury，CLI）、酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝损伤和病毒性肝炎等［1-2］，其中CLI 是由药物滥用、过量饮酒或接触肝毒性物质造成的肝损害，是肝病发生的前兆，进一步发展可引起不同程度的肝细胞坏死、脂肪肝、肝硬化及肝癌等严重肝病，是临床最常见的肝损伤类型之一［3-4］。受损或死亡的肝细胞释放的内源性分子会触发无菌性炎症，该分子称为损伤相关分子模 式（damage associated molecular patterns，DAMP），是死亡细胞释放的不协调的自身结构，包括蛋白质、三磷酸腺苷、胆汁酸和热休克蛋白等。DAMP 与其受体结合，如与主要位于巨噬细胞上的Toll 样受体（Toll-like receptors，TLR）结合，触发细胞因子和趋化因子基因转录激活，从而导致一系列免疫反应。这些反应依赖于一种蛋白质复合物的组装，即核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体。NLRP3 炎症小体的激活诱导炎症因子生成，随后吞噬细胞从血液中募集到肝的坏死区域清除细胞碎片，促进组织修复，以维持“组织内稳态”。然而，这些吞噬细胞分泌的有毒化合物，如蛋白酶和活性氧，一旦在肝中大量积累，就会因其水解和氧化活性而导致进一步肝损伤。因此，在CLI药物治疗中，靶向炎症小体可能是一种很有前途的方法。

1 NLRP3炎症小体的结构

炎症小体是细胞内对微生物和内源性危险信号产生反应的多蛋白信号复合物，在先天性免疫反应中发挥关键作用［5］。NLRP3 炎症小体是研究最广泛的炎症小体，由NLRP3 蛋白、凋亡相关的含胱天蛋白酶激活和募集结构域的斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）和下游效应蛋白胱天蛋白酶1 前体组成［6］。NLRP3 是细胞质中一种重要的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR），包含3 种结构域，即富含亮氨酸重复结构域、具有ATP 酶活性并介导自身寡聚的中央核苷酸结合寡聚结构域及招募ASC 的氨基酸末端嘧啶结构域［7］。NLRP3 炎症小体充当“细胞哨兵”，感知细胞内稳态的变化，以PRR 依赖性方式对DAMP 和病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）作出反应［8］。

2 NLRP3炎症小体的启动和激活

经典的NLRP3 炎症小体激活遵循2 步模式：启动和组装［9］。在启动阶段，PAMP 或DAMP〔如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）〕激活TLR，通过复杂的信号激活少数转录因子，如NF-κB。随后上调NLRP3 炎症相关成分的表达，包括NLRP3、促炎细胞因子和胱天蛋白酶1。第二步是NLRP3 炎症小体的组装和激活［10］。NLRP3 激活的细胞机制在NOD 样受体家族中是独特的，NLRP3 是唯一已知的被许多致病性和无菌性炎症信号间接激活的成员［11］。研究表明，NLRP3 炎症小体可以通过3 种不同信号途径激活：规范或经典的NLRP3 炎症小体激活、非规范的NLRP3 炎症小体激活以及最近替代的NLRP3 炎症小体激活，其中替代的NLRP3 炎症小体激活也称为一步NLRP3 炎症小体激活。

规范或经典的NLRP3 炎症小体通过2 步机制激活：启动和激活。在启动阶段，TLR、NLR 和细胞因子受体的配体通过髓样分化因子88/NF-κB 途径诱导白细胞介素1β 前体（pro-interleukin-1β，pro-IL-1β）和NLRP3 的表达。在激活阶段，PAMP 或DAMP 通过多种分子和细胞事件促进NLRP3 炎症小体组装，如K+外流、Cl-外排、线粒体功能障碍、活性氧（reactive oxygen species，ROS）释放、线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）产生和溶酶体破坏［12］。钾外排是NLRP3 主要激活机制。许多细菌成孔毒素、胞外ATP 或溶酶体破裂均可打开嘌呤能受体通道，形成孔洞结构或者改变细胞膜通透性，引发离子流动，进而激活NLRP3 炎症小体。线粒体功能发生障碍，导致mtDNA和ROS释放，进而通过钾依赖和非依赖性激活触发NLRP3 炎症小体激活。非规范性NLRP3 炎症小体激活由革兰阴性菌的LPS 启动，识别小鼠（或人类）胱天蛋白酶11（或胱天蛋白酶4和胱天蛋白酶5），从而激活NLRP3炎症小体。在该途径中，TLR4 通过NLRP3 上游的TLR4/TRIF/RIPK1/FADD/CASP8（胱天蛋白酶8）信号轴即足以激活人和猪单核细胞中的NLRP3 炎症小体。

在许多肝肾疾病中，氧化应激相关的炎症和细胞焦亡是重要的致病因素，最终导致急性肝和（或）肾衰竭［13］。氧化应激与炎症密切相关，ROS是氧化应激的主要产物，被认为是NLRP3 炎症小体活化的关键调控因素之一。转录因子核因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2）可通过抗氧化基因调节炎症引发的氧化损伤［14］。已知抗氧化酶血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）可由氧化应激诱导，其表达受Nrf2 信号通路的调节。在氧化应激增加的状态下，Nrf2 可从细胞质迁移到细胞核，然后与抗氧化反应元件结合，导致HO-1 和其他抗氧化基因如谷胱甘肽-S-转移酶的转录［15］。这些内源性抗氧化剂可减少ROS 产生，抑制NLRP3 炎症小体激活［16］。

NLRP3 炎症小体激活进一步诱导细胞焦亡的发生。细胞焦亡属于一种程序性细胞死亡［17］，并伴有炎症反应。细胞焦亡与细胞凋亡和自噬不同，其在形态学上的显著特征是细胞表现出膨胀的表型，从质膜上吹出大气泡［18］，破坏质膜并释放细胞成分和促炎介质，包括IL-1β和IL-18，而这一过程部分依赖于胱天蛋白酶1［19］。已有研究表明，细胞焦亡的发生存在2 种机制［20］：①经典途径，依赖于胱天蛋白酶1的激活，进而通过pro-IL-1β和pro-IL-18蛋白水解诱导IL-1β和IL-18成熟。此外，胱天蛋白酶1还可裂解消皮素D（gasdermin D，GSDMD）。GSDMD是胱天蛋白酶11 和胱天蛋白酶1 的特异性底物，可被切割生成N 端GSDMD（GSDMD-N）和C 端GSDMD（GSDMD-C）。而GSDMD-N 是一种活性成孔蛋白，可促进膜孔形成，引发炎症因子释放和细胞焦亡［21］；②非经典途径，不依赖于胱天蛋白酶1，人类细胞中的胱天蛋白酶4 和胱天蛋白酶5 以及小鼠细胞中的胱天蛋白酶11 取代了胱天蛋白酶1，直接切割GSDMD 并引发细胞焦亡［22］。事实上，一旦被激活，NLRP3 会自我寡聚并招募衔接蛋白ASC，后者会自我结合成螺旋状纤维组装体，充当胱天蛋白酶1 前体的切割和激活平台。然后，活化的胱天蛋白酶1 介导促炎细胞因子的成熟和分泌，包括IL-1β 和IL-18。NLRP3 可识别来自病原体以及环境或宿主的因子；宿主细胞细胞质中的多种内源性损伤信号可激活NLRP3炎症小体，如胆固醇、ATP、β-淀粉样蛋白和尿酸单钠晶体。因此，NLRP3 炎症小体不仅在宿主抵抗病原体方面发挥重要作用，还介导各种炎症性疾病的发生，包括CLI、非酒精性脂肪性肝炎、2 型糖尿病、动脉粥样硬化、痛风和脂肪肝病，表明NLRP3 可能成为上述疾病的潜在干预靶点。

3 天然产物靶向NLRP3防治化学性肝损伤

CLI 是反应性代谢物被相应的酶代谢后形成的，反应性代谢物可与细胞蛋白结合或触发细胞脂质过氧化，引起氧化应激和肝细胞坏死，从而激活炎症反应。CLI一般由药物、四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）和乙醇等化学性肝毒物引起，其损伤程度与接触这些物质的剂量和时间呈正相关。如今，CLI发病率越来越高，可进一步发展为急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）和死亡，已成为世界范围内的公共卫生问题，越来越多的学者致力于探索有效改善肝损伤的药物。不同于化学合成药物，天然产物具有安全、有效和廉价的优势［23］。许多从药用植物中分离的天然产物通过调节NLRP3 炎症途径，对多种化学物质诱导的肝损伤具有有益作用。

3.1 药物诱导的肝损伤

药物性肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）是CLI 的一种类型，能造成肝功能衰竭，其表型复杂，包括几乎所有目前已知的肝损伤类型，严重程度包括从肝生物化学的无症状升高到黄疸、暴发性肝衰竭甚至死亡［24］。DILI 可大致分为“特异质”和“内源性”2 类：特异质性DILI 与药物剂量无关且难以预防和诊断，为作用于肝的药物不良反应，发病率和病死率均较高；内源性DILI 多是由药物或其代谢产物直接引起的损伤，与药物服用剂量有关，其发生是可预测的，最典型的代表是对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）诱发的肝损伤［25］。APAP作为一种用于控制疼痛和发热的非处方药，过高剂量会引起急性肝损伤甚至肝衰竭。APAP 过量时经细胞色素P450 同工酶E1（cytochrome P450 2E1，CYP2E1）代谢成为N-乙酰-对-苯醌亚胺（N-acetylp-benzoquinone imine，NAPQI）的过程中会产生超氧阴离子，使ROS/活性氮（reactive nitrogen species，RNS）产生增加，超出抗氧化系统的清除能力，使机体处于氧化应激状态，激活NLRP3 炎症小体，最终导致肝细胞损伤［26］。

黄芩苷（baicalin）是一种黄酮类化合物，从常用中草药黄芩的干燥根提取而得，具有较好的调节脂质、抗氧化、调节胰岛素水平和功能、抗炎、保护心肌细胞等多种生物学功效［27］，其通过Nrf2依赖的方式调节NLRP3炎症小体，从而减轻APAP诱导的肝损伤。研究表明，在Nrf2基因敲除小鼠中，黄芩苷对APAP诱导的肝活化胱天蛋白酶1和IL-18 表达水平降低以及肝内出血、核固缩和肝细胞坏死的缓解作用全部减弱。此外，黄芩苷可通过诱导细胞质中Nrf2累积，导致NLRP3炎症小体激活，进而使IL-18表达增加，从而诱导肝细胞增殖，促进肝再生，减轻APAP诱导的急性肝损伤［28］（图1）。

图1 化学性肝损伤中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体作用机制及天然产物的潜在分子靶点.PAMP：病原体相关分子模式；DAMP：损伤相关分子模式；TLR4：Toll样受体4；MAPK：丝裂原激活蛋白激酶；Nrf2：转录因子核因子E2相关因子2；ARE：抗氧化反应元件；IL-1β：白细胞介素1β；Keap1：Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1；HO-1：抗氧化酶血红素加氧酶1；NQO1：NAD（P）H 醌氧化还原酶1；pro-IL-1β：IL-1β 前体；mtROS：线粒体活性氧；TXNIP：硫氧还蛋白相互作用蛋白；ASC：斑点样蛋白；pro-caspase-1：胱天蛋白酶1 前体；GSDMD：消皮素D；N-GSDMD：氨基末端GSDMD；LPS：脂多糖；TNF：肿瘤坏死因子；RIP1：受体相互作用蛋白1；p-MLKL：磷酸化修饰混合谱系激酶结构域样蛋白；APAP：对乙酰氨基酚；CCl4：四氯化碳；LPS/D-GalN：脂多糖联合D-半乳糖胺.图中数字表示作用于NLRP3炎症小体的天然产物对应的参考文献.

五味子是虎耳草科苗族药用和食用植物，广泛分布于中国。山奈酚（kaempferol）是五味子中的主要类黄酮成分，具有广泛的生物活性［29］，如抗氧化、抑制内质网应激和炎症反应、阻止细胞凋亡。据报道，山奈酚主要通过抑制高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）/TLR4/NF-κB 信号通路，下调CYP2E1 蛋白表达，上调HO-1 和NAD（P）H 醌氧化还原酶1（NQO1）蛋白表达，恢复抗氧化来抑制NLRP3 炎症小体的激活，最终达到保肝作用［30］（图1）。

3.2 四氯化碳诱导的肝损伤

CCl4是一种经典的肝毒性化学物质，其引起的肝损伤与临床上ALF 密切相关，被广泛用于肝毒性评估和制备动物模型筛选抗肝损伤药物［31］。目前普遍认为CCl4导致肝损伤的主要机制与CCl4本身及其自由基代谢产物有关。在肝内质网中存在的多种形式的CYP450 酶中，CYP2E1 被认为是CCl4生物活性和CCl4介导的肝损伤相关的关键代谢酶。CCl4一旦形成三氯甲基自由基，则与分子氧反应，形成剧毒的三氯甲基过氧自由基；然后攻击膜脂中的多不饱和脂肪酸，从而发生连锁反应，导致脂质过氧化，进而产生过量ROS，导致肝细胞受损，引起肝损伤［32］。受损肝细胞的细胞内容物释放到细胞外环境中，可触发NLRP3 炎症小体激活，进一步促进CCl4诱导的肝损伤的炎症反应［33］。研究表明，经CCl4处理的C57BL/6 小鼠肝中CYP2E1 基因和蛋白表达水平及NLRP3炎症小体成分表达均升高。

从植物红景天中提取的活性成分红景天苷（salidroside）能通过下调CYP2E1 表达，减少脂质过氧化和抑制NLRP3 炎症小体激活，从而保护小鼠免受CCl4诱导的急性肝损伤［28］。从冬凌草中提取的一种天然化合物冬凌草甲素（oridonin）越来越受到人们的关注。冬凌草甲素能够减少促炎细胞因子生成，抑制肝细胞凋亡，具有肝保护活性。此外，冬凌草甲素能够增加肝CYP450 酶的表达和活性水平。体外实验表明，冬凌草甲素降低肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）中NLRP3 炎症小体的激活，提示其可靶向HSC 中NLRP3 炎症小体降低CCl4诱导的肝纤维化［34］（图1）。有研究表明，在损伤刺激下触发的细胞焦亡水平与肝损伤的严重程度呈正相关。存在于十字花科蔬菜的天然化合物异硫氰酸苯乙酯（phenethyl isothiocyanate）以GSDMD 为靶点，降低细胞焦亡标志蛋白水平，如NLRP3、活化的胱天蛋白酶1和GSDMD，抑制细胞焦亡，以浓度依赖性方式减轻刀豆蛋白A 诱导的炎症性肝损伤和CCl4诱导的CLI［35］（图1）。上述结果表明，天然产物不仅可清除自由基，抑制脂质过氧化，还可阻止细胞焦亡，从而阻断NLRP3 炎症小体激活。

3.3 酒精诱导的肝损伤

由酒精滥用引起的酒精性肝病（alcohol-associated liver disease，ALD）在全球普遍存在，对公共卫生构成严重威胁［36］。乙醇主要在肝代谢，长期饮酒可促使肝脂肪变性的形成，即ALD 的早期阶段，随后可进一步恶化为ALD，最终发展为肝硬化［37］。通常，ALD 的特征是肝细胞内出现异常脂质沉积和炎症反应，伴有促炎细胞因子如IL-1β 水平升高［38］。目前，虽已确定了ALD 发展过程中的几个关键事件，如肝炎和氧化应激增加被认为在ALD 的发展中起关键作用［39］，但该疾病的详细病理机制及其与其他风险因素（如年龄、肥胖和吸烟）的相互作用仍然难以确定。隐丹参酮（cryptotanshinone）作为中药丹参的一个重要有效成分，是NLRP3 炎症小体的特异性抑制剂。隐丹参酮通过阻断Ca2+信号，诱导线粒体ROS 生成，后者是NLRP3 炎症小体的重要上游激活信号分子。在体内，隐丹参酮可减弱小鼠模型中胱天蛋白酶1 激活和IL-1β 分泌，进而治疗NLRP3 炎症小体相关的炎症性疾病［40］。深入研究发现，急性和慢性乙醇处理增加ROS/RNS 的产生，同时降低细胞抗氧化防御水平。氧化应激增加可能导致肝脂质过氧化、炎症、细胞凋亡和坏死，形成一个正反馈回路，显著加重ALD 程度。硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）是肝氧化应激的促进剂之一［41］，它可分别抑制细胞质和线粒体中的硫氧还蛋白1 和2。据报道，在慢性乙醇处理大鼠正常肝细胞系BRL-3A 前用传统中药宁夏枸杞（Lycium BarbarumL.）预处理，可显著减轻24 h 乙醇暴露诱导的TXNIP 过表达、细胞凋亡增加、炎症细胞因子分泌、NLRP3炎症小体激活、ROS 产生和抗氧化酶表达降低，而TXNIP 的沉默抑制激活的NLRP3 炎症小体，增加氧化应激，加重细胞凋亡；表明宁夏枸杞以TXNIP依赖的方式抑制NLRP3 炎症小体的激活，从而减轻酒精诱导的肝损伤［42］。此外，TXNIP 增加也能促进胱天蛋白酶1 介导的细胞焦亡通路，提示细胞焦亡可能是ALD 发展的另一个重要因素。中药琴叶榕（Ficus pandurataHance）根不同溶剂提取物具有肝保护作用。研究发现，琴叶榕根水提物可更有效抑制肝损伤模型中NLRP3、胱天蛋白酶1 和IL-1β表达升高，从而缓解过量摄入乙醇诱导的肝损伤，这可能与抑制细胞焦亡通路有关［43］。上述结果表明，天然产物以氧化应激依赖的方式抑制NLRP3炎症小体的激活，降低细胞焦亡，从而减轻酒精诱导的肝损伤。

3.4 脂多糖与D-半乳糖胺协同作用诱导的肝损伤

LPS 是一种基于葡萄糖胺的糖脂，是革兰阴性细菌外壁的一种成分，可诱导炎症反应，导致肝损伤［44］。D-半乳糖胺（D-galactosamine，D-GalN）是一种氨基糖，可抑制RNA 合成，并增强肝对LPS 毒性的敏感性［45］，其与LPS 协同作用时可造成肝细胞广泛凋亡、坏死而引起ALF，其特点是诱导全身炎症和过氧化应激反应，与人类暴发性ALF 相似。因此，LPS 和D-GalN（LPS/D-GalN）联合使用已被接受为探索临床肝衰竭机制和筛选潜在治疗药物的常用方法之一［46］。因此，抑制炎症和（或）氧化应激可能是缓解急性肝损伤发展的潜在方法［47］。此外，氧化应激还通过激活促炎症途径加速炎症反应，包括NLRP3炎症小体途径。

瑞香素（daphnetin）是白瑞香（Daphne papyraceaWall. ex Steud.）的主要有效成分，具有多种药理作用，尤其是抗炎作用。瑞香素可通过激活自噬、抑制NF-κB 和MAPK 信号通路、阻断NLRP3炎症小体激活来调节炎症反应，从而减轻LPS/D-GalN 诱导的ALF［48］。从新疆甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch）中分离得到的甘草查耳酮A（licochalcone A）通过抑制TXNIP/NLRP3 以及TLR4/MAPK 和NF-κB 信号通路，有效缓解LPS 诱导的炎症反应。同时，甘草查耳酮A 诱导Nrf2 上调，并促进AMP 活化蛋白激酶——转录因子EB 信号的自噬，这可能有助于其肝保护活性［49］。LPS/D-GalN触发肝细胞死亡，包括凋亡和坏死。坏死性凋亡是一种新型的促炎细胞死亡模式，称为“程序性坏死”。RIP1 和RIP3 激酶相互作用形成RIP1/RIP3复合物，促进混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）的招募和磷酸化。p-MLKL 转移到细胞膜上，导致膜破裂和细胞坏死，HMGB1 和IL-33 等DAMP 释放，从而诱导NLRP3 炎症小体激活。据报道，栀子（Gardenia jasminoidesJ. Ellis）果实中的主要活性化合物京尼平（genipin）降低LPS/D-GalN 诱导的RIP3、磷酸化RIP1和RIP3蛋白表达以及RIP1/RIP3坏死体复合物增加，类似于坏死性凋亡抑制剂的作用。同时，京尼平减弱LPS/D-GalN 诱导NLRP3 炎症体成分表达，并降低肝和血清IL-1β 水平。研究表明，京尼平通过抑制坏死性凋亡介导炎症相关信号通路，改善LPS/D-GalN诱导的肝细胞损伤［50］。

综上所述，天然产物能够抑制炎症细胞因子，减弱NLRP3 炎症小体的激活发挥保肝活性，靶向NLRP3炎症小体可成为治疗CLI的潜在靶点。

4 结语

NLRP3炎症小体作为一种体内平衡传感器，充当“细胞哨兵”，由病原体以及宿主细胞细胞质中的多种内源性损伤信号如胆固醇和ATP 触发。触发后，促使炎症细胞因子释放，并诱导炎症细胞死亡，其激活在CLI的发病机制中尤为重要。长期以来一直被视为潜在肝保护剂的天然产物，广泛存在于植物、蔬菜和水果中，具有减少炎症、细胞焦亡及诱导自噬的作用，且调节多种信号分子抑制NLRP3 炎症小体激活，有望成为NLRP3 炎症小体抑制剂的候选物，用于预防和治疗CLI。然而由于天然产物成分较多，分子作用机制复杂，在肝损伤方面的研究更多是基于细胞或者动物模型完成的，对于其临床疗效和潜在的不良反应还需要进一步探究。在此基础上，继续深入研究NLRP3 炎症小体活化和调控的具体机制，可为临床诊断和治疗肝病提供新的方法和途径。