硅沉着病患者和实验模型动物不同生物样本中氧化应激生物标志物及其应用研究进展

唐 蒙，刘 静，曾 明

（1.中南大学湘雅公共卫生学院卫生毒理学系，湖南 长沙 410078；2.嘉兴市桐乡市疾病预防控制中心，浙江 嘉兴 314599；3.重庆市九龙坡区疾病预防控制中心，重庆 400050）

地壳中含有约12%游离二氧化硅（SiO2），采石场、隧道和陶器行业等工人由于长期暴露于含量较高的粉尘（矽尘）中而容易发生硅沉着病（矽肺）［1］。硅沉着病是我国最常见职业病之一，每年新增硅沉着病病例＞2万例［2］。然而在世界范围内，硅沉着病预防并不理想，缺乏有效治疗方法，严重威胁从业者的健康［3］。

硅沉着病是一种以慢性肺部炎症和肺间质纤维化为特征的致命性疾病，其发生被认为与SiO2粉尘引起的氧化应激有关。SiO2粉尘诱发肺损伤的机制包括直接细胞毒性、氧化应激相关酶失衡以及炎症和纤维化细胞因子释放等［4-5］。抗氧化剂和抗氧化酶是肺抗氧化防御系统的主要成分，主要包括小分子抗氧化剂如谷胱甘肽（glutathione，GSH）和维生素C（vitamin C，VC）等及抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）等。与其他器官相比，肺极易受氧化应激影响［6］。SiO2粉尘可促使肺细胞内产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），使肺组织抗氧化防御系统受损，导致细胞损伤［7-8］。当SiO2颗粒到达肺泡时，一方面可致膜脂过氧化，破坏细胞膜；另一方面可沉积在肺泡内，被巨噬细胞摄取，通过产生ROS启动氧化应激［9-10］。

鉴于氧化应激在硅沉着病中的重要作用，本文对SiO2粉尘接触者和实验模型动物的不同生物样本，如血液、尿液、肺组织、呼出气体及支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中氧化应激生物标志物的类型、各自优点和局限性及对硅沉着病发生发展的治疗和诊断价值等进行综述。

1 血液和尿液中的氧化应激标志物

正常情况下，机体内氧化/抗氧化系统处于动态平衡状态，但SiO2粉尘暴露可直接导致机体氧化失衡。一种解释硅沉着病发病机制的自由基理论认为，肺泡巨噬细胞吞噬SiO2粉尘后，释放大量自由基和ROS［11］。当释放的自由基未完全被清除时，将增强机体内部脂质过氧化，损害肺结构［12］。ROS在硅沉着病发展中起至关重要作用［7］。除直接引起组织毒性，还可引起DNA氧化损伤导致8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG）生成增加。8-OHdG 是一种氧化性加合物，由DNA 分子中鸟嘌呤碱基第8位碳原子被羟自由基或单线态氧等攻击时产生。Sato等［13］发现，在硅沉着病模型小鼠中，血浆8-OHdG 水平在SiO2暴露后1～12 周内升高。Pilger 等［14］采集了接触过石英（主要成分是SiO2）工人的血样和尿样，发现高粉尘暴露的工人外周血白细胞DNA中存在更高的8-OHdG 水平，反映SiO2粉尘暴露后机体氧化/抗氧化系统失衡。

SiO2粉尘的暴露可通过肺部脂质过氧化诱导氧化应激［15］。硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBAR）是衡量脂质过氧化的一个重要指标。Scalia 等［16］测量了目前或以前暴露于SiO2粉尘的工人和一组非暴露受试者血浆中TBAR，发现矽尘接触者血浆中TBAR 增加且显著高于未接触组，表明较高水平的TBAR 与SiO2粉尘接触史有关。而另一种脂质过氧化物丙二醛（malondialdehyde，MDA）常与体内一些抗氧化酶一起被用来评价体内的氧化应激水平。Zhang等［17］检测发现，硅沉着病患者血清中SOD、MDA 和GSH 水平明显高于非硅沉着病对照者。SOD 活性和GSH水平升高可能反映一种代偿机制的激活，以应对硅沉着病患者ROS 生成水平增加，而MDA 水平升高则表明硅沉着病患者脂质过氧化水平增加。接触高浓度SiO2粉尘的硅沉着病患者SOD 活性也比非接触者高［18］。与非接触者相比，中国接触SiO2粉尘工人中硅沉着病患者血清MDA水平和SOD活性均升高［19］。但涉及SiO2粉尘暴露和氧化生物标志物的研究也有矛盾的结果。有研究显示，与对照组相比，在土耳其陶瓷业接触SiO2粉尘工人血清中MDA 水平升高，SOD 活性降低［15］。与之不同的结果显示，正暴露于SiO2粉尘的个体血浆SOD 活性降低，且与病情严重程度密切相关。造成以上不一致结果的原因可能与暴露因素有关，如粉尘颗粒分布、暴露强度和暴露时间以及疾病的持续时间和严重程度等。

硫醇/二硫化物稳态与机体内氧化状态有关，可作为氧化应激的一个重要指标。通过评估血清中硫醇/二硫化物的动态平衡反映接触SiO2粉尘工人体内的氧化还原状态，发现接触SiO2粉尘工人患者血清二硫化物水平明显高于对照组；此外，接触SiO2粉尘工人血清中二硫化物与天然硫醇的比值和二硫化物与总硫醇的比值也高于对照组［19］，表明在接触SiO2粉尘工人体内的氧化失衡是SiO2粉尘诱导的氧化应激的结果。

血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）是评估氧化应激的生物标志物［20］。Sato等［13］发现，硅沉着病患者血清HO-1 水平明显高于慢性阻塞性肺病患者和对照组，其中呼吸功能轻度受损的硅沉着病患者血清HO-1水平最高，与8-OHdG水平呈显著负相关。有研究表明，HO-1有助于保护宿主免受某些炎症疾病的影响，在硅沉着病模型小鼠中HO-1的诱导剂氯化血红素可抑制炎症反应，而HO-1的抑制剂锌原卟啉可增强炎症反应［13］。HO-1作为ROS的重要清除剂之一，上调HO-1可能是治疗硅沉着病的一种新策略。

Nardi等［21］测定未接触过SiO2粉尘的工人和接触SiO2粉尘但未被诊断为硅沉着病的工人血清中VC水平。结果显示，有接触史者血清VC水平显著降低，表明SiO2粉尘诱导氧化应激的发生，这可能是因为VC可与SiO2粉尘暴露期间产生的活性物质，如超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基和单线态氧发生反应。此外，对MDA 和VC进行相关性分析发现，MDA 水平与VC水平呈负相关，同时VC水平与C 反应蛋白水平也呈负相关，表明氧化应激可能参与SiO2粉尘刺激的炎症反应［22］。

综上所述，对SiO2粉尘接触者和实验模型动物的血液和尿液标志物研究提示，升高的8-OHdG、TBAR、MDA、SOD、GSH、二硫化物和HO-1水平及降低的VC水平均可表明机体内发生氧化应激，这些指标被广泛用于评估SiO2粉尘暴露后机体内氧化/抗氧化水平，尽管结果可能存在差异，但具有重要的临床意义。与呼气冷凝物、痰液或呼吸气体不同，血液和尿液中氧化应激生物标志物的测定在重复性和灵敏度方面具有显著优势，但与局部组织中的生物标志物浓度相比，也具有与临床相关性不高的问题。

2 肺组织中的氧化应激标志物

对硅沉着病组织的研究有助于理解氧化应激相关蛋白网络和分子间相互作用参与硅沉着病发生发展的具体机制。Sato 等［13］在硅沉着病患者、肺癌患者、硅沉着病尸检对象和对照组的手术标本中发现，肺内吸入的SiO2粉尘与病变肺部中HO-1表达相关，硅沉着病组HO-1阳性细胞数明显高于对照组。硅沉着病模型小鼠整个病程中，随疾病的进展，HO-1在肺组织中的表达逐渐增加。HO-1在硅沉着病患者肺部病变中持续表达，可能是因为SiO2粉尘的暴露诱导ROS增加，从而导致血清HO-1水平升高。

核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是内源性抗氧化防御的关键调节因子，调控抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）介导的抗氧化基因的转录，并保护细胞免受由ROS 累积造成的氧化应激［23］。Zhao 等［24］用抗氧化小鼠LiasH/H小鼠（通过高表达内源性抗氧化剂α-硫辛酸提高自身抗氧化能力）和野生型小鼠研究硅沉着病的发病机制，发现暴露于SiO2粉尘后，LiasH/H小鼠肺组织Nrf2 蛋白水平高于野生型小鼠；而肺组织Nrf2 免疫组织化学分析显示，野生型小鼠间质纤维化区和硅沉着病结节中Nrf2蛋白表达明显低于LiasH/H小鼠；与野生型小鼠相比，SiO2粉尘混悬液滴注后的LiasH/H小鼠肺组织中Nrf2、CAT和线粒体内SOD2mRNA 表达均增加。上述结果表明，LiasH/H小鼠可能通过Nrf2信号通路降低SiO2诱导的氧化应激，使肺组织中Nrf2相关抗氧化酶表达增加，减轻SiO2粉尘诱导的肺纤维化。

Deng 等［25］和Suh 等［26］认为，α-硫辛酸可通过上调蛋白激酶B（protein kinase，Akt）磷酸化诱导Nrf2 向细胞核转移并增加HO-1 表达。比较硅沉着病模型组和对照组大鼠Nrf2/ARE 信号通路分子的变化，发现与对照组大鼠相比，模型组大鼠肺组织中Nrf2和ARE 表达明显增加［27］。在机体保持氧化/抗氧化动态平衡时，Nrf2 并不会被活化。当受到大量自由基和ROS刺激时，氧化和抗氧化系统之间的平衡被打破，Nrf2 可进入细胞核并与ARE 结合，进而激活下游多种抗氧化基因，从而发挥抗氧化作用［28-29］。抗氧化剂萝卜硫素可使硅沉着病模型大鼠肺组织中Nrf2 和ARE 表达升高［27］，进一步表明Nrf2 信号通路调节在抑制SiO2粉尘诱导的氧化应激中起重要作用。

肺组织中MDA、总氮氧化物（total oxides of nitrogen，NOχ）、还原型GSH和CAT的活性等常被用来评价氧化应激状态。通过大鼠鼻腔滴注SiO2粉尘悬浊液建立硅沉着病大鼠模型，发现SiO2粉尘暴露使大鼠肺组织中MDA 和NOχ含量分别增加约3.3 和2.6 倍，同时肺组织GSH 含量和CAT 活性分别下降51%和60%［30］。硅沉着病的进展伴随着明显的组织病理改变，氧化应激反应明显增强，从而使肺组织乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性、MDA 和NOχ 含量、GSH 浓度和CAT活性均出现异常。

肺组织中HO-1 和Nrf2 表达水平增加、MDA 和NOχ含量上升以及GSH含量和CAT活性下降均可提示肺内氧化/抗氧化失衡，可作为评价硅沉着病严重程度和机体氧化应激水平的潜在生物标志物。肺组织活检的主要优点是直接对肺实质进行取样，可保持肺组织结构成分的空间关系并清楚地识别发生氧化应激的组织区域，进一步确定肺损伤部位，有助于研究硅沉着病发展进程中的确切机制，但其侵袭性和创伤性限制了患者的接受程度，在未明确诊断时，可采用侵入性较小的方式对患者进行肺组织活检。

3 呼出气体中的氧化应激标志物

在呼出气体及呼气冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）中已检测到几种可用于评价硅沉着病患者氧化应激状态的介质，但可能会有多种因素影响其测量，其中一个重要限制是呼出气体中测量的介质浓度很低，可能会显著增加测量误差。Mahdi 等［31］对接触过SiO2粉尘工人的呼出气体中挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOC）进行分析，发现这些化合物浓度增加与体内氧化应激发展有关［32］；SiO2接触组工人呼出气体中VOC 的平均峰面积明显高于健康志愿者组，提示接触SiO2粉尘工人和硅沉着病患者的呼气特征与对照组不同，VOC有可能作为接触SiO2粉尘的氧化应激生物标志物。

EBC 被认为是反映肺内生物过程的物质，可用于肺部疾病的诊断和预后评估［33-34］。EBC 中8-异前列腺素F2α（8-iso-prostaglandin F2α，8-iso-PGF2α）、4-羟基-2-壬烯（4-hydroxy-2-nonenal，HNE）和MDA 等是反映氧化应激状态的重要指标。Daniela 等［35］采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法测定患者（石棉肺和硅沉着病）与健康志愿者EBC、血浆和尿液中8-iso-PGF2α，HNE 和MDA 含量。结果表明，两组患者EBC 中8-iso-PGF2α 水平均较高，与尿中8-iso-PGF2α 的变化趋势一致；在所有受试者中，8-iso-PGF2α 在EBC 中的水平与尿液和血浆水平相关，表明它们可能具有潜在的替代作用。另有研究显示，硅沉着病患者EBC 中8-iso-PGF2α平均水平明显高于对照组，矽尘暴露浓度与8-iso-PGF2α 水平呈正相 关［36］。EBC 中8-iso-PGF2α对应于肺中的氧化应激过程，不受系统性疾病、药物和饮食因素的影响，是氧化应激最重要的生物标志物之一［36］。对这种在自由基催化反应中产生的花生四烯酸衍生物进行分析，是评估由SiO2粉尘引起的疾病的一种有前途的非侵入性手段。

EBC 中氧化应激标志物的定量也可通过测量HNE 来评估。研究显示，排除受试者全身性疾病的显著影响，石棉肺和硅沉着病患者EBC和尿中HNE均较高，其中硅沉着病患者EBC中HNE水平的升高具有显著性［35］。目前暂未发现任何疾病过程或治疗作用显示与EBC中HNE水平具相关性，因此可认为HNE是一个可用于检测肺部疾病的氧化应激标志物。

呼出气体及EBC中氧化应激标志物的测量有助于更好地了解硅沉着病的发病机制，监测暂时无法治愈的肺部疾病的活动性。呼出气体中VOC 以及EBC 中8-iso-PGF2α 和HNE 均有可能作为接触矽尘的氧化应激生物标志物。然而对EBC成分的分析尚未成为临床上诊断和治疗硅沉着病的金标准，仍需克服呼出的水蒸气中呼吸液滴被稀释及与EBC中存在的呼吸液滴产生位置的不确定性。但由于呼吸液滴在EBC中所占比例＜0.01%，传统的酶联免疫吸附实验无法准确测量，需采用更灵敏的方法。

4 BALF中的氧化应激生物标志物

BALF 是一种用于诊断、治疗和研究的重要介质，可评估肺泡和支气管腔内液体的细胞和非细胞成分。BALF 虽是一种侵入性方法，但耐受性良好且较安全［37］。8-iso-PGF2α 和羟十八碳二烯醇（hydroxyectadecadienol，HODE）已被认为是体内脂质过氧化的生物标志物，并有相关文献报道了这些生物标志物与各种疾病的关系。Fukui 等［38］采用液相色谱-串联四极杆质谱联用法测定SiO2粉尘暴露后BALF 中8-iso-PGF2α 和HODE 含量，发现BALF中HODE浓度在暴露SiO2粉尘24 h后显著增加，约72 h 后降至对照水平。在检测到脂质过氧化作用增强的同时，BALF中HO-1浓度在暴露SiO2粉尘后24 h升高，72 h恢复到基线水平。与之不同的是，有学者发现SiO2粉尘的暴露显著降低大鼠BALF 中HO-1 和Nrf2 水平［39］。造成这种差异的原因可能是由矽尘暴露时间不同，后者矽尘暴露时间更长，而前者只研究了暴露早期的变化。Nrf2 介导的对抗氧化应激的防御机制已被阐明。当暴露于氧化应激时，Nrf2 会被释放并移位到细胞核中，刺激细胞保护蛋白如HO-1表达［40］。

采用SiO2粉尘气管滴注染毒大鼠7 d，与对照组比较，暴露于SiO2粉尘导致BALF 中相对稳定的代谢物亚硝酸盐水平和总抗氧化力显著升高，并随SiO2浓度增加而显著增加［41］。而在脱蛋白的BALF中未发现抗氧化能力的差异，表明所有提供抗氧化能力的物质均为BALF 的蛋白质成分，而这可能是造成测量结果具有可变性的重要因素之一。

综上所述，矽尘刺激能诱导BALF 中8-iso-PGF2α、HODE、H2O2和亚硝酸盐含量增加，Nrf2 表达水平下降及总抗氧化能力增强，但矽尘暴露时间不同可能会导致BALF 中HO-1 水平存在差异。BALF 中生物标志物的定量，特别是当样本量有限时，具有一定挑战。但BALF中生物标志物的检测技术正不断发展，同时现有的检测方法也得到了适当标准化，这为硅沉着病评估和监测提供了替代选择。

5 结语

硅沉着病是一种公认的与氧化应激相关的疾病，发病机制依赖于反复慢性细胞损伤及其触发的肺内纤维化和氧化失衡。氧化应激对细胞外基质的重要性及其如何改变肺间质纤维化的细胞反应，仍有待阐明。不同来源生物样本中多种氧化应激生物标志物水平与硅沉着病发生发展相关，这些标志物能在病变早期更快出现明显改变，可能是区分矽尘暴露状态、硅沉着病发生和疾病严重性的重要候选指标，为识别潜在生物标志物并应用于临床实践提供新途径。在硅沉着病发生发展过程中，这些标志物可预测抗氧化治疗的疗效，对评估和监测患者病情有重要用途，有助于在SiO2粉尘暴露和硅沉着病之间建立更精确的剂量反应关系，为设定职业暴露限值提供参考。