高效代谢低聚木糖乳酸菌的选育及益生特性探究

杜咏怡，谭才邓，卓雨菡，姜红营，刘永英，董雪瑜，王玉珠，陈晓嘉，陈姗姗，黄 强

（广东轻工职业技术学院，广东广州 510300）

乳酸菌是一类公认安全的益生菌，常见的有乳杆菌属、双歧杆菌属、嗜热链球菌属等，在肠道中共同维护着菌群生态平衡，起到抑制有害微生物群落、调节机体免疫力等作用[1-4]，对人体健康有重大意义，目前在乳制品、饮料、微生态制剂等领域展开应用[1-3]。低 聚 木 糖（Xylooligosaccharides，XOS）是一种寡聚糖，其甜度是蔗糖的30%～40%，具有性能稳定、耐酸耐高温等特点。低聚木糖不能被人体直接代谢利用，但对机体可以起到降血糖、降血压、改善脂质代谢、防便秘、护肝等作用[1，5-7]。此外，能被肠道中的益生菌利用，特别是对双歧杆菌、乳杆菌等的增殖有积极影响[4-6]，是一种功能性寡糖类益生元。低聚木糖主要是当作益生元应用于医药、保健品行业，也作为添加剂应用于养殖饲料行业[6-7]，但在食品行业中的应用并不广泛，目前多见应用于烘焙食品及乳制品中。由于低聚木糖具有发酵困难的特性，拟筛选出能高效代谢低聚木糖的乳酸菌，以期为低聚木糖应用于乳酸菌发酵产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 筛选原料

自然发酵牛乳、自然发酵羊乳、泡菜。

1.1.2 培养基

（1）平板筛选培养基。低聚木糖质量浓度20 g/L，蛋白胨质量浓度5 g/L，酵母粉质量浓度5 g/L，吐温-80 含量1 mL/L，磷酸氢二钾质量浓度2 g/L，乙酸钠质量浓度5 g/L，柠檬酸三铵质量浓度2 g/L，七水硫酸镁质量浓度0.2 g/L，四水硫酸锰质量浓度0.05 g/L，碳酸钙质量浓度10 g/L，琼脂粉质量浓度18 g/L，pH 值6.2。

（2）液态发酵培养基。低聚木糖质量浓度20 g/L，蛋白胨质量浓度5 g/L，酵母粉质量浓度5 g/L，磷酸氢二钾质量浓度2 g/L，乙酸钠质量浓度5 g/L，柠檬酸三铵质量浓度2 g/L，七水硫酸镁质量浓度0.2 g/L，四水硫酸锰质量浓度0.05 g/L，pH 值6.2。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离筛选

将筛选材料置于适量无菌水中，并进行梯度稀释，选择适宜梯度的稀释样液涂布于平板筛选培养基上，于37 ℃下培养3 d，分别测量菌落周围透明圈直径（H）与菌落直径（C）的大小，挑取H/C 值大的菌落进行后续试验。

1.2.2 菌株代谢木糖产乳酸性能试验

将待测菌株分别接种于50 mL 液态发酵培养基中，于37 ℃的摇床中以转速180 r/min 振荡培养24 h制备成种子液。以10%的接种量将种子液转接于新鲜的液态发酵培养基（低聚木糖质量浓度80 g/L）中，于37 ℃的摇床中以转速150 r/min 振荡培养5 d。每1 d 取适量发酵液，离心后取上清液，采用EDTA 定钙法[8-9]进行乳酸含量的测定。

1.2.3 菌种分子鉴定

待测菌株用Ezup 柱式细菌基因组DNA 抽提试剂盒提取基因组DNA，用作模板用于PCR 反应扩增16S rDNA 基因片段。

PCR 扩增反应采用Takara 高保真PCR 聚合酶（PrimeSTAR HS DNA Polymerase）按说明书进行，反应程序为96 ℃预变性4 min；96 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，32 个循环；72 ℃终延伸5 min。

PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。将序列在NCBI 网站中进行同源性检索，利用MEGA 6.0 软件以Neighbor-Joining 法构建菌株系统发育树。

1.2.4 菌株耐酸试验

将菌株种子液以10%的接种量分别接种于空白对照、pH 值1.0～4.0 的液态发酵培养基中，于37 ℃的培养箱中静置4 h，间隔1 h 取样测定活菌数，计算存活率。

1.2.5 菌株耐胆盐试验

将菌株种子液按照10%的接种量分别接种于空白对照和牛胆盐质量浓度3 g/L 的液态发酵培养基中，于37 ℃的培养箱中静置8 h，间隔1 h 取样测定活菌数，计算存活率。

1.2.6 模拟人工胃液试验

配制pH 值2.0 和pH 值3.0 的胃蛋白酶液（膜过滤除菌）以模拟空腹和饱腹2 种状态下的人工胃液。取5 mL 菌悬液，于4 ℃下以转速4 000 r/min 离心10 min，用无菌生理盐水清洗2 次后重悬于5 mL人工胃液中，于37 ℃条件下以转速150 r/min 振荡处理2 h，取样测定活菌数，计算存活率。

1.2.7 活菌数测定及存活率计算

乳酸菌活菌数测定按国家标准“GB 4789.35—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验”进行。

乳酸菌存活率按以下公式计算：

式中：X——存活率，%；

N1——试验各条件培养反应后测得的活菌数，CFU/mL；

N0——空白对照试验测得的活菌数，CFU/mL。

2 结果与分析

2.1 菌株分离筛选

经过碳酸钙平板分离筛选，以溶解圈直径大小（H）与菌落直径（C）之比为指标，筛选出H/C 值大的前12 株菌（见图1）。其中，有5 株菌的H/C 值大于3.5，由高到低分别为6#（4.26）、5#（4.02）、1#（3.93）、11#（3.91）和2#（3.82），其他菌株的H/C 值均小于3.5。以这5 株菌进行后续试验进行代谢木糖产乳酸性能试验，以获得最优菌株。

图1 菌株分离筛选

菌株分离筛选见图1。

2.2 菌株代谢木糖产乳酸性能试验

菌株发酵液乳酸质量浓度测定见图2。

图2 菌株发酵液乳酸质量浓度测定

以获得的5 株菌为研究对象，考查其发酵木糖产乳酸的性能。5#菌株和6#菌株均在2 d 的时候达到产酸峰值，之后呈微下降趋势；1#、2#和11#菌株均在3 d 的时候达到产酸峰值，之后呈微下降趋势，可见，5#和6#菌株代谢利用木糖的速率快于其他3 株菌。从发酵液中乳酸质量浓度峰值来看，其大小顺序为6# ＞5# ＞1# ＞11# ＞2#，与初筛时菌株H/C 值的大小顺序相符。综上，6#菌株代谢木糖的速率快，产乳酸的量最高（达25.92 g/L）。因此，以6# 菌株为出发菌进一步进行研究，并将其命名为T-XOS-6。

2.3 菌株T-XOS-6 分子生物学鉴定

对菌株菌株T-XOS-6 进行分子生物学鉴定，通过PCR 反应获得其16S rDNA 基因片段，经测序，其大小为1 528 bp。在NCBI 网站上进行BLAST 序列比对分析，选取同源性98%以上的菌株的16S rDNA 序列利用Mega 6.0 软件以Neighbor-Joining 法构建系统发育树，菌株T-XOS-6 与Lacticaseibacillus paracasei CD-M-1（OP 491976.1）位于同一分支中，属于副干酪乳杆菌。

菌株T-XOS-6 基于16S rDNA 基因序列的系统发育树见图3。

图3 菌株T-XOS-6 基于16S rDNA 基因序列的系统发育树

2.4 菌株T-XOS-6 耐酸能力试验

益生菌需要定植于动物肠道中才能发挥其益生作用，在摄入过程中需要抵御胃酸的作用，因此具有强耐酸能力是益生菌的一个重要指标。人体胃部的pH 值一般为2.0～4.0，试验设置了pH 值1.0，2.0，3.0，4.0 这4 个梯度来探究菌株T-XOS-6 的耐酸能力。

菌株T-XOS-6 耐酸能力见图4。

图4 菌株T-XOS-6 耐酸能力

菌株T-XOS-6 在pH 值4.0 和pH 值3.0 的条件下维持非常高的存活率，第4 h 的存活率分别为98.62%和94.85%。菌株T-XOS-6 在pH 值2.0 的条件下维持较高存活率，第2 h 和第4 h 的存活率分别为88.76%和80.66%。pH 值1.0 的强酸性条件下，虽然菌株的耐受能力整体表现明显下降（第2 小时和第4 小时的存活率分别为65.43%和48.29%），但第1 小时的存活率仍然有72.39%，说明其有明显的抵抗强酸性的能力。综上所述，菌株T-XOS-6 在pH 值2.0～4.0 范围耐受能力强，具备抵抗人体大多数情况下胃部酸性环境能力。

2.5 菌株T-XOS-6 耐胆盐能力试验

益生菌定殖于肠道，需要耐受胆盐的胁迫。胆盐具有降低表面张力，使细菌的细胞膜损坏或菌体裂解，从而具有抑菌功能。人体肠道内的胆盐质量浓度一般为0.3～3.0 g/L，食物通过一般在4 h 内完成，本研究将菌株T-XOS-6 的细胞置于牛胆盐质量浓度3 g/L 的环境中处理8 h，以探究其耐受胆盐胁迫的能力。

菌株T-XOS-6 耐胆盐能力见图5。

图5 菌株T-XOS-6 耐胆盐能力

菌株T-XOS-6 在3.0 g/L 胆盐质量浓度的环境中，前4 h 的存活率均在95%以上（第4 小时为95.15%），表明其耐受胆盐胁迫能力优秀；第5 小时的存活率在90%以上，6～8 h 的存活率在80%以上，说明此菌株能长时间耐受高浓度胆盐胁迫。

2.6 菌株T-XOS-6 人工胃液耐受试验

能否顺利通过胃的消化而留存高的存活率是衡量益生菌有效性的一个重要指标，为了考查菌株T-XOS-6 耐受胃液处理的能力，试验在体外进行模拟空腹和饱腹2 种状态的试验。

菌株T-XOS-6 耐受人工胃液能力见图6。

图6 菌株T-XOS-6 耐受人工胃液能力

由图6 可知，随着作用时间的延长，菌株存活率呈下降趋势，饱腹状态的下降趋势明显低于空腹状态的下降趋势，且同等的处理时间下饱腹状态下的活菌数均高于空腹状态；在饱腹状态下，人工胃液处理1 h 时菌株的存活率为98.95%，2 h 时的存活率为95.19%；在空腹状态下，处理1 h 时菌株的存活率为91.25%，2 h 时的存活率为84.02%。一般而言，食物通过胃部的时间是在2 h 内。因此，菌株T-XOS-6 耐受胃液的能力良好，符合微生态制剂的要求。

3 结论

利用低聚木糖作为培养基唯一碳源进行乳酸菌选育，获得一株高效代谢低聚木糖的乳酸菌T-XOS-6，经分子生物学鉴定其为副干酪乳杆菌，与Lacticaseibacillus paracasei CD-M-1（OP 491976.1）位于同一分支。经初步研究，菌株T-XOS-6 代谢低聚木糖产生乳酸的速率高，在温度37 ℃，转速150 r/min的条件下发酵2 d 可使乳酸产量达到峰值。对菌株T-XOS-6 的耐酸、耐胆盐、耐胃液等益生特性展开研究。结果表明，①菌株T-XOS-6 的耐酸能力强，在pH 值2.0 的条件下第2 小时和第4 小时的存活率分别为88.76%和80.66%，在强酸性（pH 值1.0）条件下处理1 h 的存活率仍然有72.39%；②菌株T-XOS-6 的耐胆盐能力强，在高胆盐（3 g/L）的条件下处理4 h，菌株存活率在95%以上；③菌株T-XOS-6 的耐胃液能力良好，模拟胞腹状态下处理2 h 时菌株的存活率为95.19%，模拟空腹状态下处理2 h 时菌株的存活率为84.02%。

低聚木糖是一种功能性寡糖类益生元，已在医药行业、保健品行业、养殖饲料行业中展开应用，目前也逐渐在食品行业中进行开发应用。随着人们生活水平的提高，消费呈现多元化，消费者对产品质量、功能食品在生命健康方面的要求越来越高，把低聚木糖应用于乳酸菌发酵食品，将是功能性健康食品开发的一个方向，具有巨大的经济效益与应用价值。因此，选育出的乳酸菌T-XOS-6 可为低聚木糖在功能性健康食品开发中提供益生菌菌种资源，具有良好的开发前景。