不同检测方法对中国猪场仔猪球虫感染情况的对比调查

2023-10-23张择扬赵永旭

国外畜牧学(猪与禽) 2023年5期

张择扬，张军，赵永旭

(1.法国诗华动物保健公司，北京 100102；2.诗华中国科学支持与诊断中心，浙江杭州 310018)

养猪生产在本质上是一种生产投资行为，如何保证有效的投资回报率，是养猪生产者应始终关心的问题。从养猪成本占比来看，60%以上的成本来源于饲料投入[1]。被猪采食的饲料要想成为养猪生产者的收入来源——猪肉，都要通过猪肠道这个“加工厂”进行转化。因此，猪肠道的健康直接关乎猪场的经济效益和投资回报率。猪肠道一旦出现问题，轻则营养物质流失，导致饲料浪费；重则机体脱水消瘦，危及生命。刚出生的仔猪抵抗力较弱，该阶段危害其肠道健康的重要“凶手”之一就是猪囊等孢球虫。

1 病原及危害

导致初生仔猪发病的球虫只有一种：猪囊等孢球虫，其卵囊的形状犹如“双黄蛋”(图1)，双层外壳中包含两个孢子囊，通过这一形态学特征可以与其他种类的球虫进行区分。猪囊等孢球虫主要感染1～7 日龄哺乳仔猪，感染猪的年龄越小，引发的临床症状和经济损失就越严重。而对于年龄更大的猪，如保育猪、育肥猪及后备母猪等，猪囊等孢球虫的感染力不强。当仔猪摄入有感染力的虫卵后，一般要经历5 d左右的潜伏期，此阶段寄生虫体在仔猪肠道的上皮细胞中生长、繁殖，导致肠道上皮细胞受损、脱落[2]。此时母乳中的蛋白质、脂肪等营养物质将无法被仔猪的肠道吸收，导致仔猪出现腹泻症状。有研究表明，球虫感染导致仔猪断奶体重减少1 kg，达到95 kg 屠宰体重所需的时间增加9 d，经济损失约100 元/头[3]。

图1 猪囊等孢球虫孢子化卵囊

2 材料和方法

2.1 检测样本

根据猪场的规模大小，选择5～20 窝的哺乳仔猪。使用一次性聚乙烯或乳胶手套，收集产床上仔猪的粪便于采样管中，每窝一管，混样约10 g，做好标记，其内容包括：窝编号、采样日期、仔猪日龄。采完一窝更换一组手套(图2)。

图2 标记好的仔猪粪便样本

本试验是为检测仔猪粪便样本中的球虫卵囊。但是，仔猪只有在感染后的第5～7 天和第12 天才会出现两次排卵囊高峰，因此错误的采样时段会导致检测结果的假阴性。为避免漏检的情况，本试验对7～14 日龄仔猪进行第1 次采样，间隔7 d 后进行第2 次采样(图3)。将第1 次采样的粪便样本放置于2～8 ℃冰箱中保存，待完成第2 次的样本采集后和第1 次采集的样本按窝标号混合送检，全程冷链运输。

2.2 检测方法

从23 家猪场中共采集到261 份仔猪粪便样本，将每份样本一分为二，其中一份送往某高校检测实验室，由该实验室使用漂浮显微镜检法进行检测；另一份送诗华杭州科学支持与诊断实验室，使用荧光定量PCR 法进行检测。

2.3 漂浮显微镜检法

2.3.1 样本处理

将仔猪粪便样本加入到一个容器中，加入足够的饱和食盐水。

2.3.2 搅拌和过滤

将样本和盐水混合均匀，然后用过滤器对样本进行过滤，去除大颗粒物质。

2.3.3 漂浮

将过滤后的样本转移到漂浮器中，随后加入足够的饱和食盐水，使样本在盐水中漂浮。

2.3.4 观察和检测

用显微镜观察漂浮在盐水表面的颗粒，检测是否存在球虫卵或幼虫。

2.4 荧光定量PCR 法

2.4.1 样本收集

从疑似感染球虫的仔猪粪便样本中收集适量的样本。

2.4.2 DNA 提取

使用商业化的Power Fecal DNA (QIAGEN的试剂盒，从粪便样本中提取球虫的DNA。

2.4.3 PCR 反应体系准备

准备PCR 反应混合液，包括使用球虫线粒体和核糖体内转录间隔区(internal transcribed space，ITS)基因设计的引物、DNA 模板、聚合酶和缺失核苷酸。

2.4.4 PCR 反应

将PCR 反应混合液置于PCR 仪QuantStudio 3(Thermo Scientific)中，进行一系列的温度循环，包括DNA 变性、引物结合和DNA 扩增等步骤。

数据读取，根据电脑推送结果，得出试验数据。

3 结果与讨论

检测结果显示，采用漂浮显微镜检法，猪场阳性率为22%，仔猪粪便样本阳性率为3%；采用荧光定量PCR 法，猪场阳性率为78%；仔猪粪便样本阳性率为41% (表1)；并且漂浮显微镜检法结果为阳性的样本，荧光定量PCR 法也为阳性(表2)。

通过对比两种方法的检测结果，发现荧光定量PCR 法在仔猪球虫感染检测中具有明显的优势。首先，在敏感性方面，荧光定量PCR 法是检测粪便中的球虫DNA，其球虫卵囊需求数量比传统漂浮显微镜检法的少，因此结果更加敏感。这使得猪场能够及早发现隐性感染猪，即使在临床症状出现之前，也能进行干预，从而减少经济损失。其次，荧光定量PCR 法具有更高的特异性。传统的漂浮显微镜检法在卵囊计数过程中存在一定的主观性，容易受检测人员的经验和技术水平的影响。而荧光定量PCR法通过特定引物和探针的选择，可以更准确地识别仔猪球虫的DNA 序列，避免了误判和漏诊的情况。第三，荧光定量PCR 法还具有更快的检测速度和更高的自动化程度，可以通过自动化设备进行高通量的样本检测，最多一次可以检测96 个样本，大大提高了检测效率。

根据吉林农业大学宫庆龙等[4]通过检索1980—2019年的文献显示，猪囊等孢球虫在中国猪场中的流行率为9.1%。杨光友等[5]对四川省猪场调查后发现，猪囊等孢球虫的流行率为18.7%。这些结果均低于本试验中使用荧光定量PCR 法获得的42%的流行率。该结果提示，我国猪场球虫的感染率可能显著高于之前的统计数据，传统的漂浮显微镜检法检测由于敏感性较低，导致隐性感染较多，猪场不能及早发现问题。