毛竹PheFT12a基因过表达对拟南芥开花及芽发育的影响

2023-10-23张雨佳邹龙海周敏舒郭小勤

核农学报 2023年11期

张雨佳刘丽邹龙海周敏舒畅欣郭小勤

（浙江农林大学，省部共建亚热带森林培育国家重点实验室/竹子研究院，浙江杭州 311300）

毛竹（Phyllostachysedulis）是我国南方最重要的林业资源之一，在经济和生态环境等方面发挥着重要作用。毛竹有其独特的生物学特性，一旦开花，就会大面积死亡；且主要靠无性繁殖繁育，即笋芽发育形成笋，再长成竹，但自然界中毛竹笋芽发育率极低，仅为5%～8%［1］。

FLOWERING LOCUS T（FT）亚家族为磷脂酰乙醇胺结合蛋白（phosphatidyl ethanolamine-binding protein，PEBP）家族的3个亚家族之一，该亚家族只有1个结构域（PEBP结构域），该结构域在动植物中均很保守［2-3］。模式植物拟南芥（Arabidopsisthaliana）中只有1 个FT蛋白，可长距离运输调控开花时间，是成花素的主要成分之一［4-5］。随后在多种植物中也证实了FT 直系同源蛋白是成花素的主要成分。水稻（Oryzasativa）中的成花素Heading date 3a（Hd3a）调控开花的功能与FT 类似，在野生型水稻中过表达Hd3a引起早花表型，插入Hd3a拷贝数越多，早花表型越明显［6］。紫苏（Perilla frutescens）和木薯（Manihotesculenta）中FT基因的同系物均可促进开花［7-8］。近期研究发现，在拟南芥中过表达毛竹PhFT4基因可使植株提前开花［9］。麻竹（Dendrocalamuslatiflorus）中的成花素候选基因DlFT1在开花植株中的表达量显著上调，过表达DlFT1的水稻表现出强烈的早花表型，过表达DlFT1的麻竹可直接从愈伤组织中分化出小穗［10］。

除调控开花外，FT 蛋白在植物发育过程中还发挥着其他作用：光叶蔷薇（Rosawichuraiana）的两个FT-like基因功能发生了分化，其中RwFT1可能参与光周期调控及芽休眠，而RwFT2则参与冷响应及花发育［11］。在芥菜型油菜（Brassicajuncea）中过表达BjuFT会出现分枝模式和角果形状的变化，花出现畸形［12］。除促进开花外，水稻中Hd3a还可以在腋生分生组织中积累，促使侧芽向外长出形成分蘖［13］。在烟草（Nicotiana tabacum）中异位过表达陆地棉（Gossypiumhirsutum）GhFT1可使烟草开花提前，还可以促进烟草基部的侧芽生长，诱导莲座叶腋芽增多［14］。浙江农林大学分子育种与笋用林团队前期研究发现，毛竹中至少存在16个FT-like基因，推测某些FT基因可能参与笋芽发育［1，15］，但相关生物学功能仍有待进一步研究。

鉴于此，本研究拟用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技术分析毛竹PheFT12a基因的表达模式，通过聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）介导的拟南芥原生质体转化技术分析PheFT12a蛋白的亚细胞定位，通过农杆菌转化拟南芥ft突变体分析其生物学功能，旨在为深入探讨毛竹FT基因家族的生物学功能提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究中的毛竹种子采自广西桂林，将毛竹种子剥壳，用无水乙醇浸泡3 min，连续用反渗透（reverses osmosis，RO）水充分冲洗两次后浸泡2～3 d，期间每隔24 h 换一次水。将浸泡好的种子取出，均匀地平铺在已经铺好纱布的水培育苗托盘上，罩住保鲜膜，室温静置发芽，在自然条件下培养，常规栽培管理。

拟南芥种植：取干燥处理后的拟南芥种子（Col-0基因型），无水乙醇清洗1 次，再用75%乙醇洗2～3 次，每次清洗2 min 左右，于超净工作台内，将消毒好的拟南芥种子吸出，打在灭菌滤纸上晾干。晾干后，将其均匀撒在1/2 MS 固体培养基上，封口膜密封。在4 ℃冰箱内春化处理3 d，然后将其转移至育苗室，培养一周左右，将发芽的苗移至育苗基质，常规栽培管理。

1.2 总RNA提取及cDNA合成

采集生长2 个月的毛竹实生苗各组织，迅速放入液氮中。采用Trizol（Invitrogen，美国）法提取各组织总RNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA 完整性，用超微量紫外分光光度计（NanoDrop One，美国）检测所提取RNA 的OD260/OD280纯度值和浓度。用DNaseⅠ（TaKaRa，大连）处理提取总RNA，去除其中残留的DNA。cDNA 合成参照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反转录试剂盒（TaKaRa，大连）的说明进行操作，置于-80℃保存备用。

1.3 毛竹PheFT12a基因克隆

根据PheFT12a序列，运用Primer Premier 5.0软件设计引物（表1），由杭州有康生物科技有限公司合成。以毛竹叶片cDNA 为模板行PCR 扩增。PCR 反应体系共50 μL：Green Taq Mix 25 μL，10 μmol·L-1上下游引物各2.5 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 15 μL。PCR 反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34个循环；72 ℃延伸10 min。将回收产物连接pMD18-T 克隆载体（TaKaRa，大连）并转化，挑取阳性克隆交送杭州有康生物科技有限公司测序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 生物信息学分析

参考文献［4-5，16］中的FT亚家族信息，从拟南芥基因组数据库（https：//www.arabidopsis.org/）和水稻基因组数据库（http：//www.ricedata.cn/gene/index.htm）中下载相应序列；毛竹FT亚家族成员的鉴定及分析方法借鉴Zhao 等［1］的研究，以拟南芥和水稻中已公布的AtFT及Hd3a序列作为基准序列在毛竹基因组数据库（http：//forestry.fafu.edu.cn/db/PhePacBio/blast/blast_cs.php？tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg）中进行本地blast，Evalue 值设为1e-10，将比对结果用TBtools（v1.059）软件从毛竹基因组数据库中进行抽取，将提取序列用Pfam（PF01161）及HAMMER3.0 软件进行验证；利用GSDS 2.0 进行基因结构分析；利用Clustal W 网站（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）进行多序列比对；利用MEGA X 软件中的最大似然法（maximum likelihood，ML）构建蛋白质矩阵的系统进化树，进化模型选择Jones-Taylor-Thornton（JTT）model，bootstrap 值设为1 000以检验各分支可靠性；利用Expasy的protparam在线软件（http：//web.expasy.org/protparam/）计算氨基酸理化性质；通过Expasy 的ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白质的亲、疏水性；利用PRABI 的SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）进行蛋白质二级结构预测；以水稻Hd3a 蛋白结构为模板，通过Swiss-Model（http：//swissmodel.expasy.org/interactive）进行三级结构预测；利用PlantCARE 在线软件对起始密码子上游2 000 bp 的序列进行启动子顺式作用元件分析；采用NCBI Conserved Domain Database（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）软件分析蛋白保守结构域。

1.5 qRT-PCR

根据获得的PheFT12a基因cDNA序列，采用Primer Premier 5.0 设计引物（表1），由杭州有康生物科技有限公司合成。以在毛竹各组织及条件下稳定表达的PheUBQ为内参基因［10，17］。PCR反应体系共10 μL：cDNA 0.5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.4 μL，TB Green®Premix Ex Taq™ II（TaKaRa，大连）5 μL，ddH2O 3.7 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，39个循环；每个反应设定3次。采用2-ΔΔCt法计算毛竹PheFT12a在不同组织的相对表达量，采用IBM SPSS Statistics26.0软件进行单因素方差分析。

1.6 亚细胞定位

根据PheFT12a序列设计含有酶切位点引物（表1），以前期获得的目的基因克隆质粒为模板进行PCR 扩增，电泳、切胶回收目的条带。

通过同源重组的方法构建亚细胞定位重组载体：用BamHⅠ对植物荧光表达载体pCAMBIA1300-GFP的质粒进行单酶切，酶切体系为50 μL：10×QuickCut Green Buffer 5 μL，BamHⅠ1 μL，载体2 μg，加ddH2O至总体积为50 μL，30 ℃金属浴酶切5 min，电泳检测是否酶切完全，切胶回收。运用同源重组酶将目的基因扩增片段纯化产物与酶切后的载体连接，连接体系为：10 μL 目的基因2 μL，载体1.5 μL，5×CEⅡBuffer 2 μL，ExnaseⅡ3 μL，ddH2O 1.5 μL，37 ℃金属浴连接30 min。将连接产物转化至DH5α中，涂布于50 μg·mL-1卡那霉素的溶菌肉汤（Luria-Bertani，LB）固体培养基上培养。挑取单克隆，液体培养基培养，对单克隆进行菌液PCR检测，将含重组质粒的菌液送至杭州有康生物科技有限公司测序。将测序正确的阳性菌扩大培养，再进行无内毒素质粒大提。

选取在育苗基质中培养1～2 周大小的拟南芥，通过酶解液法提取原生质体，利用PEG 法将构建好的载体转化至原生质体。制片后用激光共聚焦显微镜（Leica，德国）观察蛋白定位。

1.7 植物表达载体构建

用XbaⅠ和KpnⅠ对表达载体pCAMBIA1301 进行双酶切，酶切体系为50 μL：XbaⅠ1 μL，KpnⅠ1 μL，10×QuickCut Green Buffer 5 μL，载体1 μg，加ddH2O至总体积为50 μL，37 ℃金属浴酶切30 min，电泳检测是否酶切完全，切胶回收。将酶切后的表达载体与目的基因片段进行重组反应，后续操作同亚细胞定位载体构建。将测序正确的阳性菌扩大培养之后进行质粒小提。

1.8 拟南芥遗传转化

选择已开花且初具果荚、茎叶健壮的拟南芥ft突变体，剪去其果荚，浇透水备用。在含利福平和卡那霉素YEP 固体培养基上接种含pCAMBIA1301-PheFT12a载体的阳性农杆菌，28 ℃培养48 h，挑取单菌落接种于YEP 液体培养基，28 ℃培养至OD600=0.8～1.0，离心收集菌体，用提前配好的转化液（50 mL：0.11 g 1/2 MS粉末+5%蔗糖+5 μL Silwet-77）悬浮农杆菌菌体。将拟南芥花序完全浸入转化液中，侵染20～30 s，侵染结束，暗培养24 h，转移至正常光照培养，重复侵染2 次，之后正常培养。待果荚成熟后收种，种子放变色硅胶，于4 ℃冰箱中保存。

2 结果与分析

2.1 PheFT12a基因克隆及生物信息学分析

以毛竹实生苗叶片cDNA 为模板，以全长引物PheFT12a-F/R（表1）进行PCR 扩增。电泳结果显示，扩增片段大小约500 bp，与预期目的片段大小一致（图1-A）。测序结果显示，扩增片段大小长为522 bp。

图1 PheFT12a基因克隆及生信分析Fig.1 Cloning and bioinformatics analysis of PheFT12a

生信分析显示，PheFT12a基因定位于scaffold 8，包含4个外显子和3个内含子，第2和第3外显子分别长62 和41 bp，具有FT基因典型的结构特征（图1-B），内含子的剪接位点为保守的GT-AG。

PheFT12a基因编码173 个氨基酸，含有PEBP 保守结构域，属于FT-Like 亚家族。与AtFT 氨基酸序列相似性为60.8%，与Hd3a 氨基酸序列相似性为59.78%，与OsFTL12 氨基酸序列相似性为94.15%。蛋白序列比对结果显示，PheFT12a的85 位为保守的酪氨酸残基Y，同时含有维持PEBP 家族功能的T66、D73、E84、P94、G102 等9 个氨基酸残基，以及形成开花复合体（florigen activation complex，FAC）所必需的氨基酸位点D62、R64、P96、T99、F103 和R132（图1-C），该结果提示PheFT12a可能参与开花调控。

蛋白序列分析结果表明，PheFT12a蛋白分子量为19.31 kD，等电点为8.88，不稳定指数为44.66，平均疏水性为-0.22，脂肪指数为74.28。

通过Expasy 在线SOPMA 程序对PheFT12a氨基酸序列进行二级结构分析，结果显示，其二级结构主要由α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲组成，其中无规则卷曲形式最为丰富，为53.18%，其次是延伸链和α-螺旋，分别为24.86%、16.76%（图1-D）。采用同源建模法（以水稻Hd3a 为参照）预测PheFT12a的三级结构，结果显示，PheFT12a与水稻Hd3a 的三级结构一致度为61.59%，提示PheFT12a与Hd3a 的功能可能存在一定相似性（图1-E）。

2.2 毛竹PheFT12a蛋白聚类分析

将拟南芥及水稻中的FT 亚家族与毛竹FT 亚家族构建系统进化树（氨基酸序列），结果如图2 所示，PheFT12a蛋白首先与水稻OsFTL12 聚在一类，亲缘关系最近，再与水稻的其他4条FT聚在一个小分支上，其中OsFTL10 已被证明具有促进开花的功能［18］。而与Hd3a 及RFT1 亲缘关系相对较远，表明在长期进化过程中，PheFT12a蛋白功能上与Hd3a 及RFT1 存在有一定差异，但可能依旧参与开花。

图2 基于ML法构建毛竹与拟南芥、水稻FT蛋白的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of FT proteins from Arabidopsis，rice and moso bamboo on ML method

2.3 PheFT12a顺式作用元件分析

对PheFT12a起始密码子上游2 000 bp的序列进行顺式作用元件分析，结果显示，PheFT12a启动子含有响应非生物胁迫以及激素的顺式作用元件，包括ABRE（参与脱落酸响应，abscisic acid responsive elements）、P-box（参与赤霉素响应）、G-box（参与光响应）、circadian（参与昼夜节律调控）和MBS（参与干旱诱导，MYBbinding sites）等（表2）。结果表明，PheFT12a基因表达可能受外界环境如光照、干旱及激素的影响。

2.4 PheFT12a组织特异性分析

为了解PheFT12a基因在毛竹不同组织中的表达情况，对二月龄毛竹实生苗的根、茎、叶、侧芽中的基因表达量进行检测，结果显示，PheFT12a基因在叶片中表达量最高，茎次之，侧芽和根中相对较低（图3）。

图3 PheFT12a基因在不同组织中的表达量Fig.3 Expressionof the PheFT12a gene in different tissues

2.5 亚细胞定位分析

为确定PheFT12a 蛋白的亚细胞定位，构建了PheFT12a-GFP融合蛋白表达载体，通过PEG介导法转化拟南芥原生质体，在激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的亚细胞定位。结果如图4所示，对照GFP蛋白在细胞中均有分布，而PheFT12a-GFP 融合蛋白在细胞质和细胞核有明显的荧光信号，主要富集于细胞核。

图4 PheFT12a蛋白的亚细胞定位Fig.4 Subcellular localization of PheFT12a protein

2.6 转基因拟南芥表型观察

为了进一步研究PheFT12a的生物学功能，采用农杆菌介导法将重组载体35S∷PheFT12a转化ft突变体。对突变体回补植株进行DNA 水平及RNA 水平检测，PheFT12a基因已整合进突变体植株中（图5-A），并且在回补植株中稳定表达（图5-B）。

图5 PheFT12a回补ft突变体植株开花表型Fig.5 Flowering phenotype of ft mutant transformed with 35S∷PheFT12a

将1/2 MS培养基上生长7 d的拟南芥纯合植株移至育苗基质中，14 d后野生型拟南芥抽薹，ft突变体在47 d左右抽薹，而突变体回补植株在18～21 d抽薹。突变体回补植株的抽薹时间比野生型晚6 d左右，但显著早于ft突变体，部分回补了ft突变体的晚花表型（图5-C、D）。上述结果，表明，PheFT12a是开花促进因子，促进开花现象明显。

移植18 d 左右时，野生型和ft突变体主茎数均为1，而突变体回补植株主茎数增多，为2～3 个。统计分析显示，突变体回补植株的主茎数与野生型和突变体存在显著差异（图6-A、B）。在拟南芥生长56 d 时，野生型拟南芥的侧枝数平均为15 个，ft突变体的侧枝数约为16 个，而突变体回补植株的侧枝数显著增加，达到23～24 个（图6-C、D），说明PheFT12a会影响拟南芥侧芽发育。由此可见，PheFT12a可以影响拟南芥开花时间，还可以参与拟南芥侧芽发育。

图6 PheFT12a回补ft突变体植株主茎及侧枝表型Fig.6 Stem and lateral branch phenotype of ft mutant transformed with 35S∷PheFT12a

3 讨论

FT 蛋白最初被证实是成花素的主要成分之一，决定着植物的开花时间［4-5］。近年来，越来越多的研究表明，FT蛋白还可促进鳞茎形成［19-20］、块茎形成［21］、侧枝生长及芽的形成［22-23］以及改变植株形态［24］。

不同物种中FT亚家族成员数量差异很大，拟南芥和水稻中分别有1和13个［4，16］，玉米（Zeamays）中有15个［25］。通过全基因组分析，本研究从毛竹基因组数据库（V2.0）中鉴定到18个FT成员。本研究从毛竹中获得的FT基因，与水稻中的OsFTL12相似性最高（图2），其编码的氨基酸序列含保守的PEBP结构域、维持PEBP蛋白功能的保守氨基酸及形成开花复合体的必需氨基酸（图1），推测本研究中的PheFT12a可能影响植物开花时间。

多种植物中的研究结果表明，FT-like 蛋白主要在细胞质和细胞核富集（图4）［26-27］。毛竹中FT基因家族各成员表达量均较低，转录组测序很难检测到PheFT12a的表达［1，28］。本研究通过qRT-PCR 检测到PheFT12a在叶中表达量最高，茎次之，在根和侧芽中表达量均很低。FT基因的表达易受外界环境因子的影响。菊花（Chrysanthemummorifolium）CmFT的表达具明显的昼夜节律特性［29］；毛竹PheFT6和PheFT17的基因表达受昼夜节律、温度、干旱等外界环境的影响［15］。本研究中PheFT12a基因启动子上包含多个干旱、光照及激素相关的顺式作用元件，推测该基因的表达可能受上述外界环境的影响。

如前所述，FT 蛋白最初被证实是成花素，拟南芥FT被CONSTANS（CO）激活后与内质网膜蛋白FTINTERACTING Protein 1（FTIP1）相互作用，从而介导转运以诱导开花［30］，反之FT 功能丧失后开花延迟［31］；水稻Hd3a 蛋白从叶片运输到顶端分生组织中，先与14-3-3 蛋白相互作用，然后与FD 蛋白结合，形成FAC，继而激活下游开花基因APETALA1（AP1）表达，诱导水稻开花［6，27］。另外，水稻中的RFT1和OsFTL10都可促进开花［18，32］。在多种植物中发现，FT-like在其他发育阶段也发挥着重要作用，水稻中的成花素蛋白Hd3a 还可以提高水稻分蘖数［13］。异源过表达棉花GhFT1可以促使烟草基部侧枝增多，诱导莲座叶片腋部出现更多的腋芽［14］。小麦（Triticumaestivum）中的FT-B1可影响每穗的总小穗数［33］。杨树（Populus）的FT2基因过表达可导致开花显著提前［34］，还可以调控杨树年生长周期［35］。同为禾本科的毛竹有性繁殖和无性繁殖并存，开花很不规律，开花时间很难预测。本课题组前期研究发现，在长期进化过程中，毛竹PheFT6和PheFT17的功能可能发生变异，PheFT6可能影响笋芽休眠状态解除，PheFT17基因可能参与笋芽的发育［15］，但生物学功能并未证实，有关毛竹FT亚家族各成员生物学功能的研究鲜见报道。Yang等［9］研究发现毛竹PhFT4可促进拟南芥开花。与前人研究不同的是，本文中的毛竹PheFT12a基因既可以影响拟南芥开花时间，也可以影响拟南芥芽发育，暗示该基因的功能存在分化的可能性。