高效液相色谱-串联质谱法测定血液中草铵膦及其代谢物3-甲基膦基-丙酸的含量

王学虎 ,袁 敏

(1.江苏省公安厅 物证鉴定中心,南京 210012;2.南京海关 工业产品检测中心,南京 210019)

草铵膦是非选择性、内吸附型转基因耐除草剂作物,已被广泛用于农业生产[1]。法庭科学中最常见的是利用草铵膦故意破坏庄稼、植物案件,也有草铵膦投毒案件,因其毒性一般,死亡者大多是服毒自杀。由于草铵膦具有较强的极性和水溶性,含磷酸基团和氨基酸基团,以及缺乏发色基团等特性,气相色谱-质谱法[2]和液相色谱-串联质谱法[3]测定其含量时均需要衍生步骤,操作复杂,重复性差;非衍生化测定方法有离子色谱法[4]、离子色谱-串联质谱法[5]以及液相色谱-高分辨质谱法[6-7]。最为普遍的还是采用液相色谱-串联质谱法[8-15]测定环境样品或食品中草铵膦原体及其代谢物的含量。对于基质复杂的法庭科学样品如人血,主要侧重于草铵膦原体检验[4],将原体与代谢物同时检验的文献较少[16],而这些方法大多需要经过固相萃取小柱净化,步骤繁琐,并且所用的色谱柱价格昂贵,检测成本高。

联合国粮食及农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)农药残留联席会议(JMPR)报告显示,山羊、蛋鸡饲喂含草铵膦的饲料后,羊奶、鸡蛋及其组织和排泄物中的主要残留成分为草铵膦游离酸,还有草铵膦游离酸代谢物3-甲基膦基-丙酸和少量的草铵膦-N-乙酰、2-甲基膦基-乙酸[17],但未见对中毒死者血液中草铵膦及其代谢物的报道。本工作通过两例草铵膦中毒致人死亡案例,研究了死者血液中草铵膦原体及其代谢物,明确了草铵膦中毒死者血液中具有检验价值的目标物;并优化血液前处理方法,采用高效液相色谱-串联质谱法测定草铵膦及其代谢物的含量,以实现人血中草铵膦及其代谢物的快速筛查检验。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

LCMS-8050 型液相色谱-质谱联用仪;KQ3200DB数控型超声仪;Centrifuge 5430型离心机;XW-80A 型涡旋混合器。

草铵膦、3-甲基膦基-丙酸、草铵膦-N-乙酰单标准溶液:100.0 mg·L—1。

草铵膦和3-甲基膦基-丙酸混合标准储备溶液:取适量的草铵膦、3-甲基膦基-丙酸单标准溶液,用水稀释,配制成草铵膦、3-甲基膦基-丙酸质量浓度均为20.0 mg·L—1的混合标准储备溶液。使用时,用水稀释至所需质量浓度。

乙腈、氨水、乙酸铵均为色谱纯;二氯甲烷为分析纯;试验用水为去离子水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Dikma Polyamino HILIC 色谱柱(150 mm×2.0 mm,5 μm);柱温40 ℃;流动相A 为含5 mmol·L—1乙酸铵的1.25%(体积分数,下同)氨水溶液,B 为乙腈;流量0.6 mL·min—1;进样量2μL。梯度洗脱程序:0～2.0 min 时,A 为20%;2.0～6.0 min时,A 由20%升至95%,保持2.0 min;8.0～8.1 min 时,A 由95%跳转至20%,保持1.9 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,负离子(ESI—)模式;多反应监测(MRM)模式;碰撞气为氩气;雾化气为氮气,流量3 L·min—1;加热气为氮气,流量10 L·min—1;干燥气为氮气,流量10 L·min—1;接口温度300 ℃,加热块温度400 ℃,脱溶剂管温度250 ℃。其他质谱参数见表1,其中“*”代表定量离子;因未购置到2-甲基膦基-乙酸标准品,参照文献[10]设置2-甲基膦基-乙酸的质谱参数。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

取血样0.4 mL于具盖离心管中,加入0.2 mL水和1.2 mL乙腈,涡旋1 min,超声10 min,于不小于4 000 r·min—1的转速离心5 min;取上清液,加入1.2 mL 二氯甲烷,涡旋1 min,于不小于4 000 r·min—1的转速离心5 min;取上层水相,经0.22μm 水相滤膜过滤,滤液按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

草铵膦及其代谢物大多为阴离子结构,直接检验时一般普通反相色谱柱难以保留或者峰形太差[8,11],因此通常采用衍生化方式先将目标物衍生成中性分子,然后再进行检测[3]。非衍生化直接检验时一般需要使用强碱性流动相,并且要求色谱柱具有较强的耐碱性[6-7,9-16,18]。本工作选用酸度耐受范围为pH 0～13,且价格低廉的Dikma Polyamino HILIC色谱柱(150 mm×2.0 mm,5μm),对流动相体系进行考察。对于HILIC色谱柱,通常使用乙腈作为有机相。当以1.25%氨水溶液为水相时(不添加乙酸铵),草铵膦及其代谢物3-甲基膦基-丙酸、草铵膦-N-乙酰出峰太早,均无法被保留;当在其中添加1 mmol·L—1乙酸铵时,3种目标物峰形均不好;当添加5 mmol·L—1乙酸铵时,草铵膦、3-甲基膦基-丙酸和草铵膦-N-乙酰的峰形较好;当水相中乙酸铵浓度达10 mmol·L—1时,草铵膦、3-甲基膦基-丙酸和草铵膦-N-乙酰的峰面积均下降,这是由于在ESI—扫描模式下,乙酸铵会起到抑制离子化作用。综合目标物峰形和实际检测效果,试验选择的流动相体系为含5 mmol·L—1乙酸铵的1.25%氨水溶液-乙腈。

2.2 草铵膦中毒死者血液中目标物的确定

为研究草铵膦中毒死者血液中的原体和代谢物,取1份空白心血和两份口服草铵膦中毒死者的心血,按照血液、水、乙腈的体积比为1∶1∶3对其进行处理,目的是确保草铵膦及其代谢物都能进入上清液。结果显示:空白心血中无干扰[图1(a)],两份中毒死者心血中除了检出草铵膦原体,还检出两种代谢物3-甲基膦基-丙酸和草铵膦-N-乙酰,未检出代谢物2-甲基膦基-乙酸[图1(b)],与JMPR报告不一致[17],但代谢物草铵膦-N-乙酰的信号强度很低。原因可能是WHO 描述的食品中毒死者的“暴露”毒物时间长,而口服草铵膦中毒死者的心血“暴露”毒物时间短,草铵膦部分脱氨基,代谢为3-甲基膦基-丙酸,少量草铵膦乙酰化,代谢为草铵膦-N-乙酰,而极少3-甲基膦基-丙酸脱亚甲基,代谢为2-甲基膦基-乙酸,或者中毒者因死亡停止新陈代谢,导致3-甲基膦基-丙酸的代谢尚未完成。因此,草铵膦中毒死者心血中主要以原体草铵膦和代谢物3-甲基膦基-丙酸为主,并含有少量草铵膦-N-乙酰。由于死者心血中草铵膦-N-乙酰含量极低,在检验上无价值,因此对于草铵膦中毒死者的血液等体内生物检材,应侧重于草铵膦原体和代谢物3-甲基膦基-丙酸的检测。

图1 空白心血和口服草铵膦中毒死者心血中草铵膦及其代谢物的MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatograms of glufosinate-ammonium and its metabolites in the blank heart blood and heart blood of poisoning decedents caused by oral glufosinate-ammonium

2.3 前处理方法的选择

草铵膦及其代谢物3-甲基膦基-丙酸均属于强极性有机物,无法使用有机溶剂萃取、净化和浓缩,对于血液样品,优先选用乙腈沉淀蛋白。取0.4 mL草铵膦中毒死者心血,按照血液、水、乙腈的体积比分别为1∶0∶3,1∶0.5∶3,1∶1∶3,1∶1∶4,1∶1∶5,1∶1.5∶5,1∶2∶5加入一定量的水和乙腈,考察了血液、水、乙腈的体积比对蛋白沉淀效果和草铵膦、3-甲基膦基-丙酸峰面积的影响。结果表明:当水的比例较小时,血液会凝聚成团,影响上机检测,但继续增大水的比例,会出现悬浮的红细胞,导致过滤困难和色谱柱堵塞;当血液、水、乙腈的体积比为1∶0.5∶3时,蛋白沉淀效果较好,且草铵膦和3-甲基膦基-丙酸峰面积均较大,信噪比高。乙腈加水沉淀蛋白本质上属于稀释,可能会增加目标物在低浓度水平下漏检的风险,且不同来源血液的基质效应对定量分析影响较大。因草铵膦及其代谢物3-甲基膦基-丙酸易溶于水、难溶于有机溶剂,在蛋白沉淀后的上清液中添加一定量的二氯甲烷,可以使乙腈与二氯甲烷互溶并与水分层,从而有效去除非极性或弱极性杂质,使草铵膦及其代谢物保留在水相中。试验选择加入与乙腈相同体积的二氯甲烷,结果发现草铵膦和3-甲基膦基-丙酸的峰面积和信噪比均比不加二氯甲烷时的大。综上分析,试验选择以血液、水、乙腈、二氯甲烷的体积比为1∶0.5∶3∶3进行前处理。

2.4 基质效应

用水稀释草铵膦和3-甲基膦基-丙酸混合标准储备溶液,配制成质量浓度为0.4,2.0,8.0 mg·L—1的混合标准溶液,按照仪器工作条件进行测定,记录草铵膦和3-甲基膦基-丙酸的峰面积;按照试验方法对空白心血进行处理,然后在获得的空白提取液中加入混合标准溶液,配制成0.4,2.0,8.0 mg·L—1的基质匹配的混合标准溶液,每个浓度水平制备6组平行样,按照仪器工作条件进行测定,记录草铵膦和3-甲基膦基-丙酸的平均峰面积。以相同浓度水平目标物在基质匹配的混合标准溶液和在水配制的混合标准溶液中的峰面积百分比计算基质效应。结果显示:3 个浓度水平下,草铵膦的基质效应为71.7%～84.4%,表现为基质抑制效应;3-甲基膦基-丙酸的基质效应为85.5%～95.5%,表现为轻度基质抑制效应。为减小基质效应的影响,试验选择采用基质匹配的混合标准溶液系列建立工作曲线。

2.5 工作曲线、检出限和测定下限

取空白心血0.4 mL,加入0.1,0.2,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0,4.0,8.0,12.0,16.0,20.0 mg·L—1的草铵膦和3-甲基膦基-丙酸混合标准溶液各0.2 mL,配制成目标物质量浓度为0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 mg·L—1的基质匹配的混合标准溶液系列,按照1.3节试验方法进行处理(去除添加0.2 mL 水的步骤)和测定。以目标物的质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标,采用加权最小二乘法进行回归运算。结果显示:草铵膦和3-甲基膦基-丙酸工作曲线的线性范围均为0.2～10.0 mg·L—1,线性回归方程分别为y＝7.783×103x—3.794×102和y＝6.807×104x—5.119×103,相关系数分别为0.999 6和0.996 2。

采用空白样品加标的方法,参考GA/T 1900—2021《法庭科学 生物检材中毒物毒品定性定量检验方法通用要求》,结果显示,草铵膦和3-甲基膦基-丙酸的检出限均为0.1 mg·L—1,测定下限均为0.2 mg·L—1。

2.6 精密度和回收试验

在空白心血中加入适量的混合标准溶液,得到质量浓度为0.4,2.0,8.0 mg·L—1的基质匹配加标血样,每个浓度水平制备6个平行样,按照试验方法进行处理和测定,计算回收率;然后在1 d内6个不同时间点对其进行测定,并在同一时间连续测定6 d,计算草铵膦及其代谢物峰面积的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.7 样品分析

按照试验方法对两份实际案例获取的草铵膦中毒死者的心血进行分析。结果显示:样品中草铵膦质量浓度分别为5.8 mg·L—1和7.5 mg·L—1,代谢物3-甲基膦基-丙酸质量浓度分别为5.3 mg·L—1和5.8 mg·L—1,草铵膦中毒死者心血中草铵膦原体和代谢物-3-甲基膦基-丙酸含量均相对较高[4,8],容易检出。

本工作明确了草铵膦中毒死者血液中草铵膦原体的主要代谢物为3-甲基膦基-丙酸,提出了高效液相色谱-串联质谱法测定草铵膦和3-甲基膦基-丙酸含量的方法。该方法所需检材量少,前处理简单、快速,为探索强水溶性的毒物萃取开辟了新的途径,对除草剂草铵膦中毒的快速筛查检验具有很好的参考价值。