汉黄芩素调控TLR4/MAPK/NF-κB信号通路对糖尿病肾病大鼠肾纤维化的影响

张旭东,任桂灵,陈慧慧,陈 纭,朱 捷

(1. 中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院药剂科,安徽 合肥 230031;2. 安徽医科大学药学院,安徽 合肥 230032)

糖尿病是近年来常见的代谢性疾病,会引发一系列糖尿病并发症如糖尿病肾病 (diabetic nephropathy, DN),DN是一种严重的微血管糖尿病并发症,以尿蛋白为主要临床表现,也是终末期肾脏疾病常见的继发原因[1]。 DN的发病机制及其复杂性可能与高血糖、脂代谢障碍、肾小球血流动力学、炎症反应和纤维化的发生有关[2]。大量临床和基础实验表明,持续的炎症反应在 DN 中起着至关重要的作用[3]。高血糖可刺激肾小球内皮细胞及细胞分泌炎症因子如 IL-6、MCP-1 等,国外的相关研究报道可以通过减少 NLRP3/ASC 炎症小体来预防小鼠2型糖尿病和1型糖尿病的炎症和肾损伤[4]。同时,也有研究显示,黄酮类化合物二氢槲皮素(dihydroquercetin)通过抑制活性氧 (ROS) 和肾组织中的 NLRP3 炎症小体可以对高脂饮食(HFD)/ streprozozo催产素(STZ)注射诱导的DN模型大鼠的肾脏起到明显的保护作用[5]。除此之外,还有报道表明,外源性硫化氢通过抑制H9c2心脏细胞中Toll样受体4 (TLR4)/核因子(NF)-κB信号通路及其下游NLRP3炎症小体的激活来减弱高糖诱导的心肌细胞炎症[6]。TLR4是一种刺激包括MAPK和NF-κB通路在内的几种下游通路的受体,是NLRP3炎性小体通路的关键调节因子,NF-κB能够促进NLRP3等促炎细胞因子的合成,因此,NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的激活,参与了炎症和纤维化反应[7]。由此我们进一步推测,在DN模型中,通过靶向TLR4/MAPK/NF-κB信号通路抑制NLRP3炎性小体的激活,是否可以对DN大鼠抗肾纤维化产生有效的保护作用。

近年研究发现,许多中药和中成药,包括芍药总苷、黄芪总皂苷等,可以通过抑制一些信号通路如JAK/STAT的激活,降低下游炎症因子和纤维化因子的表达,进而缓解DN的发生和发展。汉黄芩素是植物黄芩的主要药用成分之一,具有抗炎和抗氧化等多种药理作用,一直被广泛应用于肿瘤、炎症等多种疾病治疗研究[8]。汉黄芩素是从植物黄芩中分离出来的活性成分,具有抗炎和抗氧化等多种活性,已有研究证实了其保护肝脏的作用。汉黄芩素在体外具有促进间充质干细胞向功能肝细胞分化的作用,并为体内CCl4诱导的肝纤维化提供有效的治疗。本研究旨在探究汉黄芩素对DN大鼠肾纤维化损伤是否具有治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 健康成年SD、SPF级大鼠,(200～220) g,60只均购自安徽医科大学动物实验中心,动物生产许可证号:SYXK(皖)2023-4571。饲养环境:室温 (23～25) ℃,相对湿度50%～60%,饲料由安徽医科大学实验动物中心提供,动物可自由饮水摄食。本动物实验均遵循动物实验伦理要求。

1.1.2实验试剂 汉黄芩素(货号:GD-GSJ532-674;纯度>98%)购自逊希公司;二甲双胍购自大连美仑生物科技有限公司规格:0.25 g /片);链脲佐菌素购自齐鲁制药有限公司;24 h 尿蛋白量(24 h-Pro)、 尿素氮 ( BUN )、 肌酐 ( SCr )、 Masson 染色试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司; BCA蛋白浓度测定试剂盒、DAB化学发光试剂盒购自南京建成生物技术有限公司;TLR4、MAPK、NF-κB、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白抗体均购自美国Sigma公司。高脂高糖饲料配方(蔗糖 20%+猪油 10%+胆固醇 2.5%+常规饲料 67.5%)。

1.1.3实验仪器 多功能酶标仪(瑞士罗氏公司);凝胶成像系统(上海勤翔科技有限公司);电泳设备(美国Beckma公司);电子分析天平(德国 Leica 公司);Mini ProteanTeraCell 型垂直电泳转印系统(美国 Bio-Rad 公司);SC-2546 低速离心机(美国Beckma公司);倒置荧光显微镜(蔡司);贝克曼库尔特 AU5800 全自动生化分析仪 (日本奥林巴斯Olympus有限公司生产,型号: TC-XDS-500C)。

1.2 方法

1.2.1构建DN大鼠模型及实验分组 除对照组外,其余各组大鼠均采用腹腔注射链脲佐菌素 65 mg·kg-1联合高脂高糖喂养12周的方法构建 DN 大鼠模型。 造模完成后,各组分别连续 28 d 灌胃给予相应药物或生理盐水,每天1 次,汉黄芩素低剂量组、汉黄芩素中剂量组、汉黄芩素高剂量组的药物使用剂量分别为50、100、150 mg·kg-1,二甲双胍组为阳性对照,其药物使用剂量为500 mg·kg-1。每组10只大鼠。

1.2.2各组大鼠空腹血糖(FBG)含量检测 于给药前至给药后的28 d内每间隔1周,尾静脉取血,通过血糖仪测定各组大鼠 FBG 含量。

1.2.3各组大鼠体质量、24 h-Pro、BUN、SCr含量检测 给药完成后,收集各组大鼠尿液和血液,离心取上清,并按照试剂盒说明书步骤检测各组大鼠24 h-Pro和BUN、SCr含量。

1.2.4HE染色检测肾组织病理损伤 组织固定包埋后石蜡切片,将蜡块固定在切片机上,切片厚度 4 μm,烘干;脱蜡及水化:二甲苯Ⅰ 20 min→ 二甲苯Ⅱ 20 min→无水乙醇Ⅰ 5 min→无水乙醇Ⅱ 5 min→90%乙醇 3 min→80%乙醇 3 min→70%乙醇 3 min→超纯水 3 min;HE 染色:切片置于苏木精染液 10 min,流水冲洗 10 min 至组织蓝化,再浸入伊红染液 30 s,流水冲洗切片 3 min 后于显微镜下观察染色效果。将染色后的切片于无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各脱水 10 min,二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各透明 10 min;封片:将封片液滴在组织上并盖上盖玻片,于 60 ℃烘干;镜检拍照:通过玻扫仪采集图片。

1.2.5Masson染色检测肾组织纤维化情况 按照上述步骤将各组大鼠肾组织制成切片,并按照Masson染色试剂盒说明书步骤进行染色,染色完成后在显微镜下观察肾纤维化状况,并以胶原面积(蓝色着色)所占面积百分比计为胶原容积分数(CVF)。

1.2.6免疫组化检测相关蛋白表达 按照上述步骤将各组大鼠肾组织制成切片,经内源性过氧化物酶阻断剂阻断、抗原修复、组织封闭后,滴加NLRP3抗体(1 ∶500),孵育过夜,对应二抗孵育2 h,滴加DAB显色液,于倒置荧光显微镜下观察染色结果。

1.2.7Western blot检测相关蛋白表达 通过15% SDS-PAGE分离蛋白质,并在200 mA和1 h条件下,将蛋白质转移至PVDF膜。将膜在含有5%脱脂奶粉的TBST溶液中于室温封闭1 h左右。将膜与TLR4、MAPK、NF-κB、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ抗体在4℃孵育过夜。用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次,每次10 min,在室温下与山羊抗兔IgG一起孵育1 h。最后,用ChemiQ4600min化学发光成像系统成像,并通过ImageJ测定蛋白条带的灰度值。

2 结果

2.1 汉黄芩素对DN大鼠FBG的影响与对照组相比,模型组大鼠给药前和给药后第 7、14、21、28 d 的 FBG 含量明显升高 (P<0.01) ;与模型组相比,汉黄芩素各剂量组和二甲双胍组大鼠给药后第 7、14、21、28天的 FBG 含量明显降低 (P<0.01) ,差异均有统计学意义。见Tab 1。

2.2 汉黄芩素对DN大鼠体质量、24 h-Pro、BUN、SCr的影响与对照组相比,模型组大鼠体质量、24 h-Pro、BUN、SCr含量均升高 (P<0.01) ;与模型组相比,汉黄芩素各剂量组和二甲双胍组大鼠体质量、24 h-Pro、BUN、SCr含量均降低 (P<0.01) ,差异均有统计学意义。见Tab 2。

2.3 HE染色检测汉黄芩素对DN大鼠肾组织病理损伤的影响与对照组相比,模型组大鼠肾组织出现肌束紊乱、炎性细胞浸润、弥漫性水肿、肾小球体积增大、系膜增生,肾小管扩张,肾间质大量炎性细胞浸润等病理学改变;与模型组相比,汉黄芩素各剂量组和二甲双胍组大鼠肾组织病理损伤明显得到改善。见Fig 1。

2.4 Masson染色检测汉黄芩素对DN大鼠肾纤维化的影响与对照组相比,模型组大鼠肾血管壁及肾小球、肾小管间质丝状胶原沉淀明显增多;与模型组相比,汉黄芩素各剂量组和二甲双胍组大鼠肾组织纤维化明显得到改善。见Fig 2。

2.5 免疫组化检测各组大鼠肾组织NLRP3表达情况与对照组相比,模型组大鼠肾组织NLRP3表达明显增加;与模型组相比,汉黄芩素各剂量组和二甲双胍组大鼠肾组织NLRP3表达明显减少 (P<0.01) ,差异均有统计学意义。见Fig 3。

Fig 1 Pathological changes of rat kidney tissue in different treatment groups detected by HE staining (×200)

Tab 1 Effect of baicalin on FBG content of DN rats

Tab 2 Effects of baicalin on body mass, 24 h-Pro and serum BUN and SCr in DN rats

Fig 2 Masson staining of renal fibrosis injury in different treatment groups of rats (×200)

2.6 Western blot检测TLR4、MAPK、NF-κB、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达与对照组相比,模型组TLR4、MAPK、NF-κB、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达明显上调 (P<0.01) ;与模型组相比,汉黄芩素各剂量组和二甲双胍组TLR4、MAPK、NF-κB、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达明显下调 (P<0.01) ,差异均有统计学意义。见Fig 4。

3 讨论

近年来,糖尿病的患病率和发病率在世界范围内持续上升。DN是糖尿病的主要微血管并发症之一,也是导致终末期肾病(end-stage renal disease, ESRD)的重要原因之一。然而,目前DN的发病机制仍未完全阐明。大量的报道证明,蛋白尿是DN的主要临床表现,也是糖尿病并发症如心血管疾病的重要危险因素。临床研究显示,只有通过严格控制血压、血糖、血脂水平以及生活方式干预,才能减缓DN的进展,但仍不能阻止其向ESRD进展[9]。因此,迫切需要寻找新的有效药物来干预DN。DN的主要病理特征是肾小球硬化和肾小管间质纤维化,抑制肾纤维化已成为DN治疗的重要措施之一。在本研究中,我们发现不同浓度的汉黄芩素均能逆转造模后DN大鼠FBG、体质量、24 h-Pro、BUN、SCr的升高,这就表明汉黄芩素可以改善由造模引起的肾功能下降。此外,HE染色和Masson染色结果同样证明了这一点,结果显示不同浓度的汉黄芩素均能逆转造模后DN大鼠肾组织的病理损伤以及肾脏纤维化程度,然而,汉黄芩素改善DN大鼠肾脏功能的机制仍不清楚,这也是我们研究的重要内容。

Fig 3 Immunohistochemical detection of NLRP3 inflammatory vesicles expression in kidney tissue of rats in different

Fig 4 Changes in expression of related proteins in kidney tissue of each group of rats

近年来,临床和动物实验研究中越来越多的证据表明,NLRP3炎症小体激活参与了包括DN在内的多种糖尿病并发症的病理过程[10]。NLRP3炎性小体是炎性小体家族中的典型成员,在本研究中免疫组化染色结果显示,与对照组相比,模型组大鼠肾组织中NLRP3表达明显增加,而汉黄芩素和二甲双胍给药后能够逆转造模引起的NLRP3表达的增加。这就提示我们汉黄芩素可能通过抑制肾组织中NLRP3的表达来发挥延缓DN进展的作用,同时说明抑制NLRP3炎症小体的激活可能为早期DN患者的治疗提供了非常有意义的参考[11]。然而,目前对高血糖状态下肾脏NLRP3炎症小体激活的分子机制和信号通路尚不清楚,同时,汉黄芩素通过何种分子机制调控NLRP3炎症小体激活也不明确,需要进一步研究。

TLRs作为模式识别受体,可通过多种炎症因子的释放触发信号级联。一些分子和细胞事件被认为是NLRP3炎性小体激活的触发因素,包括K+外排、Ca2+信号、ROS、线粒体功能障碍和溶酶体破裂。有研究显示,可溶性尿酸通过TLR4介导的信号通路增加人原代肾近端小管上皮细胞中NALP3炎症小体和IL-1β的表达[12]。此外,还有报道高血糖通过上调TLR4/NF-κB信号通路及其下游NLRP3激活诱导心肌细胞炎症[13]。因此,我们有理由推测汉黄芩素是否通过靶向TLR4/NF-κB信号通路,减弱NLRP3炎性小体激活引起的肾组织炎症和纤维化损伤。有研究表明在DM患者体内的TLR4和内源性配体以及其下游激活的NF-κB等信号级联增加[14-15]。此外,TLR4的下调时会降低NF-κB信号通路的活性以及IL-1、IL-6等炎症因子的表达,同时,NF-κB也会促进NLRP3、IL -1β和其他促炎细胞因子的合成。而在本研究中,实验结果证实造模后确实会上调TLR4表达,TLR4高表达会诱导NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的激活,进而导致下游的NLRP3炎性小体激活引起DN大鼠的肾组织炎症和纤维化反应,而汉黄芩素和二甲双胍给药后可以不同程度地降低TLR4、MAPK、NF-κB以及胶原蛋白的表达。这就提示汉黄芩素可能通过抑制TLR4/MAPK/NF-κB信号通路的激活,进而减轻由体内血液中高血糖引起的肾组织炎症和肾脏纤维化,最终发挥改善和延缓DN发生发展的进程。

综上所述,本研究表明汉黄芩素能在一定程度上减轻DN大鼠的肾脏炎症反应和肾脏纤维化程度,其机制可能与抑制TLR4/MAPK/NF-κB信号通路的激活有关。