基于蛋白质组学探究针刺改善学习记忆障碍的作用机制

王 迪,杨圆圆,王 鑫,赵 健,韩增鑫,周忠光

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江 哈尔滨 150060;2.北京中医药大学东直门医院,北京 100700;3.黑龙江中医药大学附属第四医院,黑龙江 哈尔滨 150010;4.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040)

学习记忆障碍是阿尔茨海默症和轻度认知功能障碍的前驱表现,早期干预纠正能够有效地预防或减缓相关疾病的发生和发展。针刺作为中医学传统的治疗手段在改善记忆方面具有一定的临床疗效。研究显示,长期高脂饮食会导致学习记忆能力下降,同时也会引起肠道菌群的变化[1]。肠道菌群紊乱会导致其产生的神经递质、细胞因子与激素等物质发生改变,从而通过微生物-肠-脑轴作用于中枢神经系统,导致相关疾病的发生与发展。本研究采用高脂饮食诱导学习记忆障碍,利用非标(Label-free)蛋白质组定量技术筛选差异蛋白,探究针刺改善学习记忆能力的作用靶点及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取30只SPF级SD大鼠,月龄为10周龄,性别为雄性,体质量为(290.83±10.21)g,大鼠由黑龙江中医药大学动物中心提供。适应性喂养1周后进行学习记忆障碍模型制备。饲养条件为自然光照,温度为(25±2)℃,湿度为(55±5)%,大鼠可自由进食水。本实验严格按照《关于善待实验动物的指导性意见》执行。

1.2 实验试剂及器材

1.2.1 试剂 戊二醛固定液(2.5%)(北京雷根生物技术有限公司);蛋白酶抑制剂Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ与Ⅳ(Merck Millipore);胰蛋白酶(Promega);磷酸化酶抑制剂(Millipore);碘乙酰胺(Sigma-Aldrich);甲酸(Fluka);尿素(Sigma-Aldrich);二硫苏糖醇(Sigma-Aldrich);乙腈(ThermoFisher Scientific);三氟乙酸(Sigma-Aldrich);BCA试剂盒(碧云天生物技术);2-D Quant试剂盒(GE Healthcare);丙酮(杭州汉诺化工);十二烷基硫酸钠(Amresco)。

1.2.2 器材 云龙牌针灸针(0.16mm×7mm,云龙医疗器械有限公司);Morris水迷宫(国药集团化学试剂有限公司);透射电镜(HITACHI,日本);质谱仪(Q-Exactive);液相色谱质谱联用仪(R-Exactive Plus);EASY-nLC(Thermo)。

1.3 模型制备与分组

实验开始前利用水迷宫将先天型痴呆(逃避潜伏时长均值>50 s)和游泳姿势不良的大鼠剔除。按照随机数字表法将剩余实验用SD大鼠分为3组,即空白组、模型组与针刺组。模型组和针刺组大鼠在模型制备前进行Y迷宫测试。之后采用高脂饮食的喂养方式进行模型制备,模型制备时间为8周。制备模型结束后,利用Y迷宫对模型组和针刺组的大鼠进行筛选,制备模型成功者纳入实验。制备模型成功标准:Y迷宫15次测试中,正确次数下降1/3者视为成功。最后每组随机选出6只SD大鼠进行实验,最终共纳入18只。实验干预期间3组大鼠继续维持原喂养方式。高脂饮食饲料配方:63.5%基础饲料+15%猪油+20%蔗糖+1.3%胆固醇+0.2%胆盐。

1.4 干预方法

按照《实验动物常用穴位名称与定位》选取“百会”穴。使用一次性无菌针灸针(0.16 mm×7 mm)于顶骨正中向后斜刺2 mm,平补平泻手法快速捻转1 min,留针1 h,针刺1次/d。空白组和模型组仅给予常规抓取。上述干预周期为3周。

1.5 样本采集

各组大鼠Morris水迷宫完成后进行样本采集,采集前禁食12 h。麻醉方式为3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉。麻醉完成后采用左心室灌注的方式对组织进行固定,待大鼠肝脏颜色变为苍白,于冰上取脑,剥离出大鼠大脑左侧海马组织,于海马CA1区取大小为1 mm3的组织固定于戊二醛(溶度为2.5%)中。同时每组随机选取3只大鼠,于直肠粪便较多处取黄豆粒大小的直肠组织,用预冷PBS缓冲液冲洗至洁净,并于吸干水分后置于液氮中备用。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 Morris水迷宫 实验结束后利用Morris水迷宫检测各组大鼠的学习记忆能力。水迷宫直径为160 cm,高为45 cm。将隐藏平台置于4个标记象限中的1个,将水温为(24±1)℃的温水注入池中,高于平台2 cm。

①定位航行实验:随机选择入水点,让大鼠背侧入水,记录逃避潜伏期(自入水到游上隐藏平台所历时长)。大鼠寻找并到达平台后需停留10 s,若有中途入水者需将其置于平台重新计时。超过60 s未到达平台者,需对其引导,逃避潜伏时长按60 s记录,该实验共历时6 d。②空间探索实验:空间探索实验于定位航行实验完成24 h后进行,实验开始前撤除平台,随机选择相同位置将大鼠置于水中,记录大鼠在60 s内穿越原平台位置的次数,该实验共历时1 d。

1.6.2 透射电镜 各组大鼠海马组织按下列步骤进行操作。主要操作流程:锇酸(浓度为1%)固定,乙醇-丙醇梯度脱水,纯丙酮+包埋液包埋,固化,切片,3%醋酸铀-柠檬酸铅双染色,透射电镜观察各组大鼠海马组织的病理形态学变化。

1.6.3 蛋白质组学检测 各组大鼠肠组织蛋白质组学检测由景杰生物科技股份有限公司完成。主要操作流程:提取样本蛋白,胰酶酶解,液相色谱-质谱联用分析,数据库检索,数据质控,样品重复性校验。筛选出组间差异蛋白,并从Gene Ontology分析、KEGG富集分析对差异蛋白进行分析比较。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组行为学比较

定位航行实验结果显示:模型组大鼠的逃避潜伏期时间较空白组明显延长,差异具有统计学意义(P<0.05);针刺组大鼠的逃避潜伏期时间较模型组明显缩短,差异具有统计学意义(P<0.05)。空间探索实验结果显示:模型组大鼠的穿越平台次数较空白组明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05);针刺组大鼠的穿越平台次数较模型组明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠Morris水迷宫检测结果

2.2 透射电镜结果

电镜观察各组大鼠海马组织超微结构:空白组大鼠神经元排列紧密且结构完整,神经细胞核、膜清晰可见,线粒体散在分布,无肿胀、空泡,突触轮廓完整。与空白组相比较,模型组神经元细胞排列紊乱,神经元结构完整性被破坏,核膜边界不清,可见细胞核固缩,线粒体大小不一,可见肿胀、空泡,突触数量明显减少,界限不清。与模型组相比较,针刺组大鼠神经元排列整齐,结构完整,偶见线粒体肿胀,突触数量增多,界限清晰,轮廓完整。见图1。

图1 各组大鼠海马组织超微结构(1 500×)

2.3 各组大鼠肠组织差异蛋白表达及生物信息分析

利用非标(Label-free)蛋白质组定量技术,按照Pvalue<0.05时,差异表达量变化超过1.5作为显著上调变化阈值,<1/1.5作为显著下调变化阈值的标准筛选。结果表明,与空白组比较,模型组大鼠肠组织差异蛋白上调85个,下调119个;与模型组比较,针刺组大鼠肠组织差异蛋白上调123个,下调172个。见图2。

注:橙色为模型组显著上调蛋白,绿色为模型组显著下调蛋白,灰色为非显著差异蛋白。图2 各组大鼠肠道组织差异蛋白火山图

2.3.1 各组大鼠肠组织差异蛋白GO注释及富集分析 与空白组相比,在生物过程中(Biological process,BP),模型组大鼠肠组织的差异蛋白显著富集于体液免疫调节、蛋白质成熟调节、免疫反应调控、线粒体基因表达、酰胺生物合成和核糖体产生等;在细胞组分(Cellular component,CC)上,显著富集于线粒体大核糖体亚单位、细胞器大核糖体亚单位、自噬体、MHC蛋白复合物、内质网结构组成和线粒体核糖体等;在分子功能(Molecular function,MF)上,显著富集于肽抗原结合、丝氨酸型内肽酶抑制剂活性、蛋白质组氨酸磷酸酶活性、内肽酶抑制剂活性、肽酶抑制剂活性和伪尿苷合酶活性等。见图3。

图3 大鼠肠组织差异蛋白GO分析(模型组与空白组比较)

与模型组相比,在生物过程中(Biological process,BP),针刺组差异蛋白显著富集于核糖体产生、含嘌呤化合物生物合成、核酸磷酸二酯键水解、糖代谢、膜蛋白水解、过氧化氢代谢、磷酸醛醇代谢与炎症反应调节等;在细胞组分(Cellular component,CC)上,显著富集于DNA聚合酶复合物、前剪接体与内质网结构组成等;在分子功能(Molecular function,MF)上,显著富集于金属肽酶活性、DNA-定向DNA聚合酶活性、3′-5′-外脱氧核糖核酸酶活性、裂合酶活性、分子内氧化还原酶活性与肽酶活性。见图4。

图4 大鼠肠组织差异蛋白GO分析(针刺组与模型组比较)

2.3.2 各组大鼠肠组织差异蛋白KEGG注释及富集分析 与空白组比较,模型组大鼠肠组织的差异蛋白涉及的信号通路主要为补体和凝血级联、Ⅰ型糖尿病、烟酸盐、烟酰胺代谢、皮质醇的合成和分泌等。见图5。

图5 各组大鼠肠组织差异蛋白KEGG分析(模型组与空白组比较)

与模型组相比较,针刺组差异蛋白涉及的信号通路主要为百日咳、果糖和甘露糖代谢、抗叶酸抗性和toll样受体信号通路。见图6。

图6 各组大鼠肠组织差异蛋白KEGG分析(针刺组与模型组比较)

2.3.3 各组大鼠肠组织显著差异蛋白筛选 3组大鼠肠组织共同表达的显著性差异蛋白数量为41个,其中模型组较空白组显著性上调,而针刺干预治疗后显著下调的差异蛋白数量为22个;模型组较空白组显著性下调,而针刺干预治疗后显著上调的差异蛋白数量为19个。见表2。

表2 各组大鼠肠组织表达差异倍数较大的蛋白

3 讨论

学习记忆障碍可归属于中医“痴呆”范畴。《医林改错》脑髓说中曾云:“灵机记性不在心在脑……”,李时珍曰:“脑为元神之府。”金正希曰:“人之记性皆在脑中”[2],因此改善学习记忆能力需治脑。“百会”穴善治脑府疾病,古人云灸百会可强记性。本研究Morris水迷宫结果也显示,经过3周针刺“百会”穴干预后,与模型组相比较,针刺组大鼠的学习记忆能力明显提高。从电镜结果观察也发现,针刺能够明显改善学习记忆障碍大鼠海马组织内环境,维护海马组织神经元结构的完整性,减轻线粒体肿胀,促使突触数量增多。

微生物-肠-脑轴是脑和肠道之间的通讯系统,通过神经信号传导通路、免疫应答和下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴等途径发挥作用。肠道菌群异常会导致其产生的神经递质、细胞因子与激素等物质发生改变,从而通过微生物-肠-脑轴作用于中枢神经系统,导致相关疾病的发生与发展。研究显示[3],存在学习记忆障碍的大鼠,其肠道菌群结构发生了改变,而针刺能够调节肠道菌群结构,促进产生短链脂肪酸及抑制炎症的菌群生长。本研究利用蛋白质组学的检测方法,观察学习记忆障碍大鼠肠道菌群紊乱后肠道组织相关蛋白的改变,并观察针刺干预对其产生的影响,从而探究针刺“百会”穴增强学习记忆能力的可能机制。GO分析和KEGG分析结果显示,高脂饮食诱导、针刺刺激可通过多个信号途径影响学习记忆障碍大鼠的病理和生理过程,如体液免疫调节、糖代谢、过氧化氢代谢、炎症反应调节、烟酸盐和烟酰胺代谢、皮质醇的合成和分泌和toll样受体信号通路等。

从表2中可以看出,热休克蛋白90伴侣蛋白Cdc37(Hsp90 chaperone protein kinase-targeting su-bunit,Cdc37)、RT1-A2(RT1 class I,A2)、纤维调节蛋白(Fibromodulin,Fmod)和己糖激酶2(Hexokinase-2,HK2)蛋白的表达水平,不仅在空白组与模型组之间呈现出显著差异,同时在针刺组与模型组之间也具有显著差异,并且针刺组与空白组的表达趋势一致。上述结果表明这类蛋白表达水平的改变可能在针刺改善学习记忆能力中发挥作用。

Cdc37是一种信号转导因子,是热休克蛋白90的伴侣蛋白。许多受Cdc37调节的激酶与神经系统退行性疾病相关。有研究报道,Cdc37可以调节阿尔兹海默症(AD)发病机制的几种途径,包括β-淀粉样蛋白(Aβ)和微管相关蛋白(Tau)。研究报道指出,激酶与Aβ的产生或稳定性相关,而这些激酶很多已经被证实受Cdc37的调控。另外,Cdc37与热休克蛋白90协同作用对稳定Tau蛋白发生了重要作用,降低Cdc37的表达水平能够有效地清除Tau蛋白[4]。本研究结果显示,学习记忆障碍大鼠Cdc37的表达水平相对于空白组上调,而针刺干预治疗后表达下调,说明针刺能够通过调节与AD发病机制相关的蛋白从而改善学习记忆能力。RT1-A2是主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)类中的相关分子,与机体免疫应答相关。基于神经免疫信号机制的研究发现,年龄增加引起的海马体衰老会导致大鼠空间学习能力和记忆能力下降,而突触体中MHCⅠ的相关蛋白,如RT1-A2的表达水平升高[5]。本研究结果显示,学习记忆障碍大鼠RT1-A2的表达水平相对于空白组上调,而针刺干预治疗后表达下调,说明针刺能够通过抑制RT1-A2蛋白的上调从而延缓海马体衰老,改善由海马功能障碍导致的学习记忆能力下降。Fmod作为多种细胞因子和生长因子的配体,具有促血管生成、抗炎和抗纤维化特性[6]。研究表明,Fmod能够通过抑制NF-kB的活性调节细胞凋亡,而Fmod被抑制会促进凋亡相关基因的表达,导致细胞凋亡增加[7]。研究者利用链脲佐菌素诱导糖尿病模型大鼠,发现其学习、记忆能力明显减退,该研究认为大鼠学习记忆障碍是由于NF-κB信号通路被激活从而导致海马细胞凋亡引起的[8]。本研究结果显示,学习记忆障碍大鼠Fmod的表达水平相对于空白组下调,而针刺干预治疗后表达上调,说明针刺能够通过增加Fmod的表达抑制细胞凋亡,从而改善学习记忆能力,而实现该作用的信号途径可能是NF-κB信号通路,但此推论有待下一步的探究。HK2是一种与糖酵解相关的限速酶,在调控小胶质细胞糖酵解及线粒体功能方面发挥着重要作用。研究显示[9],HK2敲除会导致线粒体产生大量的活性氧,导致线粒体功能障碍,促使炎性反应发生。糖代谢异常与AD发病相关[10-12],而氧化应激亦是被广泛认可的AD发病和进展的重要因素之一,二者均能引起线粒体功能障碍,由此可推断HK2可能参与了AD的形成。本研究结果显示,学习记忆障碍大鼠HK2的表达水平相对于空白组下调,而针刺干预治疗后表达上调,说明针刺能够通过增加HK2的表达调节糖代谢,维持线粒体功能的稳定,从而改善认知功能。本研究利用蛋白质组学检测到的部分差异蛋白并没有检索到与学习记忆或认知能力相关的研究文献,值得后续进一步探究。综上,学习记忆障碍的发生涉及多个生物过程和信号转导通路,经过针刺干预后可使大部分差异表达蛋白的表达量趋于空白组,说明针刺能够通过调控与学习记忆相关的蛋白改善学习记忆能力。