针刀干预对膝骨关节炎模型兔股直肌p16、p21表达的影响

曾 欣,刘晓玲,褚洪川,汪欣月,张安然,郭长青

(北京中医药大学,北京 100029)

膝骨关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一种常见的退行性骨关节病,多发于中老年人群[1]。其病变特征主要是关节软骨和软骨下骨的结构改变,同时还累及周围的关节囊、滑膜、肌肉和韧带[2-3]。Hurley M V[4]提出肌肉功能障碍导致的关节生物应力失衡是KOA重要的危险因素。许多横断面研究[5-6]证实KOA患者的膝关节屈伸肌群肌力较正常人明显降低。Xu J等[7]进一步证实股四头肌萎缩导致软骨变性和骨赘形成,影响骨关节炎的进展。前期研究[8]已表明针刀干预能促进膝关节周围肌肉的修复,改善软组织的生物力学特性以恢复膝关节的稳定性[9-10],但具体机制尚未完全清楚。p16和p21是细胞周期负调节的关键组分[11],能诱导细胞衰老[12],与肌肉萎缩密切相关[13]。本研究将通过Western Blot法检测针刀治疗后KOA兔股直肌内p16、p21的蛋白表达变化,探讨针刀修复萎缩股直肌以改善KOA的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6月龄雄兔24只,体质量(2.50±0.2)kg,购买自北京科宇动物养殖有限责任公司(动物批号:SYXK京2016-0013,清洁级新西兰大白兔,质量合格证号:DH201601958)。本实验于北京中医药大学良乡校区动物房完成,恒温20～22 ℃,相对湿度40%～60%,单笼饲养,自由取食和饮水。实验动物处理遵守北京中医药大学实验动物中心实验动物伦理委员会的伦理要求。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 4%多聚甲醛、伊红和苏木素(北京百诺威生物科技有限公司);50%/70%/80%/90%/95%/100%酒精(国药集团化学试剂有限公司);二甲苯(北京北化精细化学品有限责任公司);石蜡(北京化学试剂公司);HE染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);PMSF蛋白酶抑制剂(美国Thermo Scientific公司);RIPA裂解液、BCA蛋白质定量试剂盒、5×蛋白上样缓冲液、1.5MTris·HCl缓冲液、1.0MTris·HCl缓冲液、30%丙烯酰胺、10×SDS-PAGE电泳缓冲液、10×蛋白电转缓冲液10×封闭、洗涤缓冲液和Tween20(北京索莱宝科技有限公司);AP(北京PPLYGEN有限公司);TEMED(美国Sigma公司);蛋白彩色Marker(北京博迈德生物技术有限公司);山羊抗兔IgG(美国Abcam公司);PVDF膜(Millipore公司);超敏ECL化学发光试剂盒、Anti-p16、Anti-p21、新型抗体稀释液和GAPDHR(北京百诺威生物科技有限公司)。

1.2.2 仪器 华友牌针刀(0.4 mm×40 mm,北京卓越华友医疗器械有限公司);脱水机、包埋机(武汉俊杰电子有限公司);石蜡切片机(美国Thermo Scientific公司);Image Pro Plus 6.0图像分析软件(美国Media Cybernetics公司);FMIOO制冰机(美国GRANT公司);-20℃/4℃冰箱、-80℃冰箱(日本SANYO公司);液氮罐(上海博谷公司);微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司);手掌型离心机(LX-100型,江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司);低温高速离心机(美国Sigma公司);蛋白质电泳系统及转膜系统、Chem Doc XRS+成像系统(美国BIO-RAD公司);电子天平(ME203E/02型,上海梅特勒-托利多仪器有限公司);超纯水机(AK-RO-C2型,艾肯水精灵);电热恒温鼓风干燥箱(北京利康科技发展有限公司);水平摇床(北京TAYASAF公司);多功能酶标仪(美国Thermo Scientific公司);X线暗盒、D72显影粉和D72定影粉(北京PPLYGEN有限公司);感光胶片(北京CWBIO有限公司)。

1.3 分组与造模

1.3.1 分组 24只新西兰兔编号,按随机数表法分为正常组、模型组、针刀组与电针组,每组6只。

1.3.2 造模 适应性喂养1周后,模型组、针刀组和电针组均采用Videman左后膝伸直位固定制动法建立KOA模型。将兔麻醉后,仰卧固定于兔台上,牵拉左下肢使膝关节伸直180°位,踝关节背屈60°位。用树脂绷带包绕经热水浸泡软化的脱脂棉垫,从腹股沟到趾头固定动物左下肢,再用医用纱布将树脂绷带固定,外缠2层高分子树脂绷带,并外套丝袜防动物撕咬,制动6周。

1.4 干预方法

1.4.1 正常组 正常饲养,不予任何处理。

1.4.2 模型组 造模后正常饲养,不予干预治疗。

1.4.3 针刀组 造模成功1周后进行针刀治疗,遵循《针刀医学》[14]中针刀操作四步规程法。将KOA兔固定后,在(股内、外侧肌腱、股二头和鹅足腱囊)股直肌周围选择2～3个条索结节点,常规备皮后,左手加压分离,右手持针刀垂直皮肤刺入,保持刀柄方向与肌腱走势相同,着重松解条索结节以及肌腱和骨面连接处,每点松解2～3刀,操作完成后拔出针刀并按压止血。每周治疗3次,治疗3周,共治疗9次。

1.4.4 电针组 造模成功1周后进行电针治疗,根据《实验针灸学》[15]结合动物比较学方法,选取梁丘、血海、内膝眼和外膝眼穴,用毫针刺入5 mm,针柄分别连接韩式穴位神经刺激仪,进行电针治疗(波形疏密波,频率2/100 Hz,强度3 mA,10 min/次)。每周治疗3次,治疗3周,共治疗9次。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 兔行为学评价 分别在造模成功后和治疗结束后,采用改良的Lequesne MG[16]膝关节级别评估法对各组KOA兔患肢膝关节进行测量评估。总评价包括疼痛、步态、关节活动度及关节肿胀程度,两名实验人员同时评估并各自打分,结果取均值并记录。并采用关节测量角度尺测量各组KOA兔左后肢膝关节被动活动范围(Passive range of motion,PROM)。分别测量关节伸展角度与屈曲角度,计算差值并记录。

1.5.2 取材方法 将各组家兔麻醉处死,左后肢备皮干净后于股骨近髌骨的前侧开口,剥离浅层筋膜,于髌上2 cm处切除两份规格为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的股直肌标本。一份迅速装瓶并液氮保存,另一份生理盐水冲洗后浸入4%多聚甲醛溶液中固定72 h,以备光镜观察。

1.5.3 兔股直肌形态学观察 采用HE染色法,将固定的肌肉组织取出,梯度酒精脱水,透明,浸蜡,包埋,切片,苏木素染色,返蓝,伊红染色,常规脱水,透明,中性树胶封片。在200倍光学显微镜下观察切片并拍照,每张切片随机取5个视野的图像,采用ImagePro Plus 6.0软件分析图像并计算固定视野内肌纤维数和肌纤维平均横截面积,观察肌肉及肌腱病理改变情况。

1.5.4 兔股直肌中p16、p21蛋白表达检测 采用Western Blot法检测,取冻存的兔左后肢的股直肌组织,研磨后,于冰上用RIPA裂解液进行裂解,离心取上层清液,BCA法测定蛋白浓度。电泳后进行电转、封闭,并用PBS稀释液稀释一抗p16、p21(稀释度1∶2 000),4 ℃摇床过夜, 充分漂洗后加山羊抗兔IgG(二抗)(稀释度1∶20 000),孵育后充分漂洗。化学发光法显色,用GAPDH做内参重复以上步骤。显影后用ImageLab进行蛋白条带的数据分析。

1.6 统计学处理

2 实验结果

2.1 兔行为学评价

2.1.1 Lequesne MG指数评分 模型组、针刀组及电针组的兔Lequesne MG评分均显著高于正常组,差异具有统计学意义(P<0.01)。干预后,针刀组与电针组均低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.01)。与电针组比较,针刀组Lequesne MG评分降低程度差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组兔Lequesne MG指数评分比较

2.1.2 膝关节被动活动范围 模型组、针刀组及电针组的兔PROM均显著低于正常组,差异具有统计学意义(P<0.01)。干预后,针刀组与电针组均高于模型组,差异具有统计学意义(P<0.01)。与电针组比较,针刀组PROM增高程度差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组兔膝关节被动活动范围比较

2.2 兔股直肌形态学观察

2.2.1 兔股直肌HE染色结果 正常组肌束排列整齐有序、大小均匀,细胞间隙匀称且未见水肿及炎细胞浸润。模型组肌束排列紊乱、大小不一,多个肌纤维萎缩,细胞间质水肿,少量炎细胞浸润。针刀组及电针组较模型组均出现肌细胞的增大和再生,细胞间质水肿及炎细胞浸润减轻。见图1。

图1 各组股直肌肌纤维横截面形态图(200×)

2.2.2 兔股直肌纤维横截面积 与正常组比较,模型组肌纤维横截面积显著减少,差异具有统计学意义(P<0.01);干预后,针刀组和电针组与模型组相比,肌纤维横截面有所恢复,差异有统计学意义(P<0.01)。与电针组比较,针刀组肌纤维横截面积增多程度差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组股直肌肌纤维横截面积与肌细胞数量比较

2.2.3 兔股直肌肌细胞数量 与正常组比较,模型组肌细胞数量显著增多,差异具有统计学意义(P<0.01);干预后,针刀组和电针组与模型组比较,肌细胞数量减少,差异有统计学意义(P<0.01)。与电针组比较,针刀组肌细胞数量减少程度差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.3 股直肌中p16、p21蛋白表达情况

Western blot法检测各组实验兔股直肌中p16、p21蛋白表达。与正常组比较,模型组p16蛋白表达显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,针刀组和电针组p16蛋白表达均降低,差异具有统计学意义(P<0.01);与电针组比较,针刀组p16蛋白表达降低程度差异无统计学意义(P>0.05)。与正常组比较,模型组、针刀组和电针组的p21蛋白表达均呈不同程度升高,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,针刀组和电针组p21蛋白表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05);与电针组比较,针刀组p21蛋白表达降低程度差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表4。

图2 各组兔股直肌p16和p21蛋白表达条带

表4 各组兔股直肌p16和p21蛋白表达比较

3 讨论

股四头肌是唯一伸膝关节肌群,在维持膝关节力学平衡中至关重要。新的研究表明[7],肌肉质量和力量的下降使关节容易疲劳,从而影响软骨的营养供应与软骨下骨的异常变化。伴随疼痛和局部肿胀等病理变化的发生,KOA患者的运动功能障碍改变了膝关节局部生物力学平衡,进一步导致股四头肌肌力减退,并形成恶性循环[17]。这与中医对KOA的认识相符。

膝骨关节炎又称“痹证”,存在由“筋痹”到“骨痹”的转变过程[18]。邱峰等[19]认为,“膝之筋”由膝关节周围的肌肉、肌腱、韧带及关节囊等构成,“膝为筋之府”,经筋在膝关节的力学传导中发挥着关键的作用[20-22]。针刀治疗KOA恰恰是通过松解膝关节周围的肌肉、韧带等软组织的粘连和挛缩,改善膝关节的超负荷应力状态,同时使局部血管、神经末梢得以恢复,促进组织的修复。即通过“调筋”以恢复经筋“束骨利关节”的功能[23]。本研究团队前期证实了针刀能够促进股直肌的蛋白质合成及抑制其降解,改善肌肉力学性能,延缓软骨退变,促进软骨的修复,以实现“调筋治骨”,可见“调筋”是针刀治疗KOA关键的环节。

细胞衰老是指由各种类型的应激导致的不可逆的细胞周期停滞和独特的细胞表型改变的过程,包括基因表达、抗凋亡通路激活、促炎症分泌或衰老相关分泌表型(SASP)的表达[24-25]。积累的衰老细胞产生SASP分子,通过自分泌或旁分泌方式作用于衰老细胞以及邻近细胞,从而加剧和传播促衰老效应[12,26],最终损害再生并介导生物组织的炎症[27]。这可能是肌肉细胞衰老和肌纤维萎缩的基础[13]。相关研究[28]表明衰老细胞分泌的细胞因子、趋化因子、基质重塑蛋白和生长因子,被证实与KOA炎症的介质重叠。因此,局部消除衰老细胞以阻断SASP获取,抑制细胞衰老进程和减少骨骼肌萎缩被认为是KOA可能有效的治疗策略[12]。综上所述,抑制KOA股直肌细胞的衰老成了针刀干预改善股直肌功能的突破口。本实验结合Lequesne MG指数评分和PROM评估的结果,证实针刀干预能够显著地改善实验兔的膝关节被动活动范围,恢复膝关节运动功能,是对前期针刀干预促进KOA兔股直肌修复作用机制的进一步深入。

一般认为,分子应激反应途径诱导细胞周期的阻滞,其中两个最主要的信号通路为p53-p21 Cip1通路和p16 Ink4a-Rb通路[29]。而p21和p16是细胞周期进展负调节中两个关键的组成部分[28,30]。p21 Waf1/Cip1能与各种细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(Cyclin-dependent kinases,CDK)相互作用并使其失活,而p16INK4A能直接与CDK4/6结合并阻断cyclinD-CDK4/6复合物形成[31],二者分别导致视网膜母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein,Rb)过度磷酸化,促进抑制性Rb-E2F复合物形成,从而抑制细胞周期进程,诱导细胞衰老[13]。多项实验研究证实,p16表达的增多导致早期细胞衰老,而p16表达的下调可以恢复关节软骨细胞的正常功能[11]。p53、p21 Cip1和p15 Ink4b也在衰老细胞中增加。

在本实验中,造模之后,p16、p21的蛋白表达显著升高,提示造模膝关节周围骨骼肌造成应激损伤后,引发了细胞周期停滞和独特的细胞表型改变,介导邻近组织的炎症,造成衰老细胞的积累和骨骼肌的萎缩。且HE染色光镜观察结果显示模型组肌束排列紊乱,有少量炎细胞浸润,肌纤维横截面积显著减少且股直肌纤维总数显著增多,证实局部炎症和肌肉萎缩的发生。

而治疗后,与模型组比较,针刀组和电针组的p16、p21蛋白表达均显著降低,针刀及电针干预均下调了该通路,提示股直肌细胞的衰老效应被抑制。针刀干预和电针干预后肌纤维横截面恢复及肌纤维股直肌细胞数量的减少较模型组具有极显著差异,进一步证实针刀对股直肌萎缩的修复作用。以上结果与行为学结果相印证。可见两种干预均打破了KOA膝周“力学失衡-股直肌萎缩”的恶性循环,有效地阻遏了膝骨关节炎的病程进展。

研究表明,电针治疗膝骨关节炎具有良好的镇痛作用[32],可通过调节中枢单胺类神经递质的平衡实现,以此缓解关节软骨损伤并促进修复[33]。而与电针干预相比,针刀干预后p21蛋白表达降低,差异有统计学意义,与兔膝关节行为学及兔股直肌HE染色形态学结果不一致,这可能是针刀与电针改善肌萎缩机制的不同之处,有待进一步研究。本实验不足之处在于样本量不足以及缺乏干预更长时间后的指标检测,有待后续实验完善。

综上,针刀干预可能通过下调p16、p21的蛋白表达,抑制股直肌细胞衰老,以改善骨骼肌萎缩以恢复力学功能,重塑膝关节内部的应力平衡,从而达到治疗KOA的目的。