CD4+CD25+CD127-调节性T细胞在老年慢性心力衰竭患者外周血中的表达水平及其预后评估价值▲

张雪飞 崔向辉 刘维潮 田 祥 耿 巍

(保定市第一中心医院心内科,河北省保定市 071000)

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)多发于老年人群,部分患者经标准化治疗后症状得以缓解,但仍有部分患者短期内出现心功能急剧下降,导致不良预后[1]。因此,寻求可预测老年CHF患者临床转归的生物学标志物,并给予积极治疗,对改善患者预后具有重要意义。血清N末端B型钠尿肽前体(N-terminal pro-B-type natriuretic peptide,NT-proBNP)是目前常用于诊断CHF的标志物之一,与CHF病情程度及预后存在一定关系,但NT-proBNP容易受到患者年龄、体质指数等因素的影响,诊断特异度不高[2]。研究发现,免疫系统功能异常与CHF发生及发展密切相关[3]。调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)是具有免疫抑制功能的T淋巴细胞亚群,CD4+CD25+Treg是Treg主要类型之一,具有免疫抑制作用,可分泌调节性细胞因子抑制机体自身免疫细胞的活化[4]。CD127lowTreg是白细胞介素17的受体,具有介导淋巴细胞生存和发育的能力。研究发现,联合检测CD127lowTreg与CD4+CD25+Treg可更好地识别T淋巴细胞[5]。根据CD4+CD25+CD127-Treg的作用机制及CHF发病机制,我们推测外周血CD4+CD25+CD127-Treg可能参与CHF发生与发展。本研究观察CD4+CD25+CD127-Treg在老年CHF患者中的表达情况,分析其预测CHF患者预后的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年4月至2020年4月我院心血管内科收治的93例老年CHF患者作为研究对象。纳入标准:(1)CHF符合《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018》[6]中的诊断标准,且经体格检查、影像学检查确诊,部分怀疑为冠心病患者经冠状动脉造影检查确诊;(2)年龄≥60岁;(3)患者均接受一般治疗(饮食指导、运动指导)及药物治疗[利尿剂(托拉塞米)+血管紧张素转换酶抑制剂(依那普利)+β受体阻滞剂(比索洛尔)+地高辛];(4)出院后完成为期1年的随访;(5)依从性好,精神正常。 排除标准:(1)合并肝功能损害者;(2)合并先天性心脏病者;(3)合并急性心肌炎、心内膜炎等其他心脏疾病者;(4)合并肺癌、肝癌等恶性肿瘤者;(5)伴自身免疫性疾病者;(6)近期使用影响免疫反应药物者;(7)伴急慢性感染或炎症性疾病者;(8)随访期间病死的患者;(9)既往行冠状动脉旁路移植术或经皮冠状动脉介入术者。其中,男性60例、女性33例,患者年龄60～75(66.6±2.2)岁,美国纽约心脏病学会(New York Heart Association,NYHA)[7]心功能分级为Ⅱ级48例、Ⅲ级31例、Ⅳ级14例,存在吸烟史23例。本研究经我院医学伦理委员会审核批准(批准文号:20180220),所有患者均签订研究知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 收集一般资料: 收集患者入院时相关资料,主要包括性别、年龄、体质指数、病因(冠心病、高血压病、心脏瓣膜病、风湿性心脏病)、NYHA心功能分级、合并基础疾病(高血压病、糖尿病、高脂血症、冠心病、心脏瓣膜病、风湿性心脏病)情况、冠状动脉病变程度、吸烟史(入院前平均吸烟≥1支/d,且持续时间超过6个月),以及入院时血清NT-proBNP水平、血小板计数、血红蛋白水平、肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)、心功能指标[左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)]。

1.2.2 检测相关实验室指标:于入院后治疗前检测相关实验室指标。(1)CD4+CD25+CD127-Treg表达水平。采集患者入院时清晨空腹肘静脉血4 mL,置于含肝素的抗凝管内,于采集2 h内送检,用于检测外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平。取单克隆抗体CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE及同型对照抗体(对照为羊抗鼠IgGγ1γ2-FITC/PE单克隆抗体)各20 μL(eBioscience公司,批号分别为:20181112、20181026、20190123、20190105),加入100 μL外周血中,室温下避光孵育15 min,再向试管中加入红细胞裂解液500 μL,室温下避光孵育10 min;加入PBS冲洗2次,使用TD-5M型离心机(济南童鑫生物科技有限公司)以1 500 r/min离心5 min,离心半径为10 cm;弃上清液后加入适量PBS,采用FACSCanto Ⅱ流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company)以前向散射光和侧向散射光设定淋巴细胞门,再以CD4侧向散射光设定CD4+淋巴细胞门,检测CD25+CD127-细胞群比例。(2)血清NT-proBNP水平。采集患者入院时清晨空腹肘静脉血2 mL,以3 500 r/min离心15 min,取上清液,采用荧光免疫法检测血清NT-proBNP水平,试剂盒购自A&D公司(批号:20180921)。(3)血小板计数、血红蛋白水平、GFR。采集患者入院时清晨空腹肘静脉血4 mL,其中2 mL用于检测血小板计数、血红蛋白水平,仪器为全自动血细胞分析仪(上海光电医用电子仪器有限公司,型号:MEK-6410P)。取另外2 mL血样本以3 500 r/min离心15 min,取上清液,采用酶法测定血清肌酐水平,试剂盒购自中山标佳生物科技有限公司(批号:20180928),计算GFR,男性GFR=(140-年龄)×体重(kg)×1.23/血清肌酐(μmol/L);女性GFR=(140-年龄)×体重(kg)×1.03/血清肌酐(μmol/L)。(4)心功能指标。采用IE33型超声诊断仪[飞利浦超声(上海)股份有限公司]测定患者LVEDD、LVEF。采用超声心动图取标准胸骨旁长轴切面,M型取样线置于左室腱索水平测量LVEDD,同时运用平面Simpson法检测患者LVEF。

1.2.3 随访。出院后采用电话及门诊复查的方式进行随访,随访时间为1年。记录患者随访1年内心血管不良事件发生情况。心血管不良事件主要包括心力衰竭恶化再次入院(患者因心力衰竭恶化再次住院接受治疗)、恶性心律失常、非致死性心肌梗死,相关诊断标准参照《内科学》[8]。根据随访结果将患者分为预后不良组和预后良好组,其中,出现上述任一心血管不良事件者则纳入预后不良组,均未出现上述心血管不良事件者则纳入预后良好组。

1.3 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。符合正态的计量资料以(x±s)表示,组间比较采用两独立样本t检验;不符合正态分布的计量资料以[M(P25,P75)]表示,组间比采用Mann-WhitneyU检验;计数资料以例数(百分比)表示,组间比较采用χ2检验,若期望值<5,则采用连续校正卡方检验;等级资料的比较采用秩和检验;一般线性双变量相关性分析采用Spearman直线相关检验;采用Logistic回归模型分析患者预后不良的影响因素;绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平预测老年CHF患者预后的价值,其中曲线下面积(area under the cure,AUC)值>0.9表示预测性能较高,0.7～0.9表示有一定预测性能,0.5～<0.7表示预测性能较差。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 CHF患者的预后情况 93例患者随访期间共30例(32.3%)患者发生心血管不良事件,纳入预后不良组,剩余63例(67.7%)患者纳入预后良好组。

2.2 两组患者观察指标的比较 入院时,预后不良组患者血清NT-proBNP水平高于预后良好组,外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平低于预后良好组(P<0.05);两组其他资料比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 两组患者观察指标的比较

2.3 老年CHF患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平与血清NT-proBNP水平的相关性 Spearman相关性检验结果显示,老年CHF患者入院时外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平与血清NT-proBNP水平呈负相关(rs=-0.248,P=0.017)。

2.4 影响老年CHF患者预后不良的多因素分析 将老年CHF患者预后情况作为因变量(1=预后不良,0=预后良好),将血清NT-proBNP水平、外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平作为自变量(以实测值纳入),进行Logistic回归分析,结果显示,入院时血清NT-proBNP过表达、外周血CD4+CD25+CD127-Treg低表达是老年CHF患者预后不良的危险因素(P<0.05),见表2。

表2 影响CHF患者预后不良的多因素分析

2.5 外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平预测老年CHF患者预后的价值 ROC曲线结果显示,入院时外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平预测老年CHF患者预后的AUC为0.831(95%CI:0.745,0.917;P<0.001),有一定的预测价值,且当外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平截断值取5.65%时,可获得最佳预测价值,此时灵敏度为0.833,特异度为0.619,约登指数为0.486,见图1。

图1 外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平预测老年CHF患者预后的ROC曲线图

3 讨 论

CHF病因复杂,随着病情加重,可导致患者出现心功能与肾功能衰竭,增加患者发生心血管不良事件的风险,导致患者预后不良[9]。蒋宏亮等[10]对189例老年CHF患者进行为期1年的随访发现,随访期间有60例患者发生心血管不良事件,预后不良发生率达31.7%。本研究93例老年CHF患者中有30例(32.3%)出现预后不良,与上述研究结果相似。因此,寻找可预测CHF患者出现预后不良的指标对于临床治疗具有重要的意义。

NT-proBNP主要由心室肌细胞合成及分泌,并经肾脏清除,主要反映心室压力与容量负荷变化,是目前诊断CHF的主要血清学标志物[11-12]。当机体心室容量负荷升高后,心肌细胞合成释放的NT-proBNP增加,血清NT-proBNP水平随之升高[13]。研究证实,CHF患者血清NT-proBNP呈高表达,且NT-proBNP表达水平与患者病情程度呈正相关,NT-proBNP表达水平越高,患者心源性再住院率及病死率越高,预后越差[14]。但临床研究发现,血清NT-proBNP水平易受患者年龄、性别、肾功能等影响,特异性欠理想,如与男性CHF患者相比,女性CHF患者血清NT-proBNP水平更高,体质指数低的CHF患者血清NT-proBNP水平明显高于正常体质指数的患者,而超重或肥胖的CHF患者血清NT-proBNP水平低于正常体质指数的患者[15]。因此,急需寻找新型生物学指标单独或联合血清NT-proBNP水平预测CHF患者的病情及预后。

近年来有学者发现,免疫系统功能异常与CHF发生及发展存在一定联系。Treg是具有免疫调节功能的T淋巴细胞,在免疫系统中发挥负向调节作用,可维持免疫耐受及抑制免疫反应[16-17]。研究发现,Treg缺乏可引起体内免疫状态失衡,导致机体免疫细胞攻击心肌细胞,加速心功能恶化[18]。CD4+CD25+Treg是具有独特免疫调节功能的T淋巴细胞亚群,具有免疫抑制功能,可通过分泌细胞因子及作用于相关信号通路来发挥免疫调节功能,在机体免疫平衡中发挥重要作用[19]。胡泽平等[20]发现,CHF患者CD4+CD25+CD127-Treg表达水平降低,且与患者心功能恶化有关,推测CD4+CD25+CD127-Treg可能对CHF患者预后有一定影响。本研究结果显示,预后不良组患者入院时血清NT-proBNP水平高于预后良好组,而入院时外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平低于预后良好组,且外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平与血清NT-proBNP水平呈负相关(P<0.05)。Logistic回归分析结果显示,外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平降低是老年CHF患者预后不良的危险因素,说明CD4+CD25+CD127-Treg低表达可能会导致老年CHF患者预后不良。分析原因可能是CD4+CD25+CD127-Treg低表达可引起患者免疫耐受功能受损,诱发针对自身抗原的病理性免疫应答,从而促进疾病的发展,导致患者预后不良。此外,CD4+CD25+CD127-Treg表达水平降低可导致患者机体免疫状态失衡,引起炎症介质大量释放,且可在一定程度上加重心肌纤维化,增加心室重构风险,不利于患者预后[21]。为进一步分析外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平预测老年CHF患者预后的价值,本研究ROC曲线结果显示,入院时外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平预测老年CHF患者预后的AUC为0.833,且当截断值取5.65%时,可获得最佳预测价值,临床上可参考外周血CD4+CD25+CD127-Treg的表达情况来预测老年CHF患者的预后。但本研究也有局限性,如未观察外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平联合血清NT-proBNP水平预测老年CHF患者预后的价值,今后将进一步深入研究。

综上所述,与预后良好的患者相比,预后不良的老年CHF患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平降低、血清NT-proBNP水平升高,外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平降低与老年CHF患者预后不良相关,推测外周血CD4+CD25+CD127-Treg表达水平在预测老年CHF患者预后中有一定的价值。