QuEChERS-高效薄层色谱法测定蔬菜中10 种拟除虫菊酯类农药残留

高猛峰 张维谊 梅 博 童金蓉 沈斯文 王 霞 宋宇迎 丰东升

（上海市农产品质量安全中心， 农业农村部食品质量监督检验测试中心 （上海）， 上海 201708）

拟除虫菊酯是从菊花中提取的天然除虫菊酯的合成衍生物， 由菊花酸酯及其酸和醇的卤化衍生物组成[1]， 具有高效、 低毒、 稳定等特点， 已经发展为继有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂后全球应用较广的第3 大类杀虫剂。 目前， 已经开发出70 多种拟除虫菊酯类农药， 主要包括氯氰菊酯、 溴氰菊酯、氯氟氰菊酯、 联苯菊酯等， 适用于蔬菜、 水果等农产品害虫防治[2～3]。 相关研究表明拟除虫菊酯类农药有蓄积性[4]， 长期接触会引发神经毒性、 生殖发育毒性等疾病[5～9]， 农产品和农业环境中拟除虫菊酯类农药残留问题日趋严重， 存在较大潜在危害。2021 年， 我国颁布实施的GB 2763-2021 《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》 对蔬菜中拟除虫菊酯类农药的残留限量值进行了严格限定， 限量值范围在0.01～10 mg/kg 不等， 其中大多数叶菜类蔬菜和芸薹属类蔬菜中的限量值在0.5 mg/kg 以上， 少部分茄果类蔬菜和瓜类蔬菜中的限量值在0.05～0.2 mg/kg 之间， 一些根茎类和薯芋类蔬菜中的限量值则低至0.01 mg/kg。 因此， 有必要建立简单、 快速、 高效的蔬菜中拟除虫菊酯类农药的检测分析方法， 以有效保障农产品食用安全和人类健康。

高效薄层色谱 （High performance thin layer chromatography， HPTLC） 是一种特殊的液相色谱， 其利用物质在同一吸附剂上吸附能力差异来进行分离， 根据目标物与标准品用同一方法所得色谱的斑点比移（Rf） 值进行定性分析， 根据斑点的灰度进行定量分析。 该方法具有前处理简单、 可实现高通量分析、 成本低等优点[10]。 目前HPTLC 已经形成了标准化仪器操作平台， 可以实现半自动化或全自动化， 进一步拓宽了应用范围， 被广泛地应用于食品中农药和兽药残留的检测分析中[11～14]， 如陈启飞[13]成功将HPTLC 应用于畜禽产品中的兽药残留检测； YUE 等[14]将HPTLC 应用在茶叶中有机磷农药检测分析中， 研究结果验证了HPTLC 在大批量农产品样品检测中的准确性和适用性。QuEChERS 是一种简单、 经济、 快速、 准确、 高效的样品前处理技术， 被广泛应用于蔬菜、 水果等基质的农药残留分析中[15～17]。 本研究拟采用改良的一步式QuEChERS 前处理技术结合高效薄层色谱法，建立蔬菜样品中10 种拟除虫菊酯类农药的快速检测方法。

一、 材料与方法

（一） 材料、 试剂与仪器大白菜、 番茄、 西葫芦、 青菜、 空心菜、 结球甘蓝等蔬菜样品购于上海市农贸市场。

10 种农药标准品： 甲氰菊酯、 氟胺氰菊酯、氰戊菊酯、 氯氟氰菊酯、 氯氰菊酯、 氟氰戊菊酯、溴氰菊酯、 氯菊酯、 联苯菊酯、 氟氯氰菊酯（德国Dr.Ehrenstorfer 公司）。 乙腈、 石油醚（60～90℃）、三氯甲烷、 环己烷、 丙酮 （德国Merck 公司），QuEChERS 提取盐包 （4 g 无水MgSO4、 1 g NaCl、1 g 柠檬酸钠和0.5 g 柠檬酸氢二钠） 和快速滤过型mPFC 净化柱（北京科德诺思技术有限公司）。

高效薄层板、 毛细管、 层析缸、 BC-D1 高效农药残留速测仪、 NS-D1 浓缩仪 （上海瑞鑫科技仪器有限公司）， Milli-Q 超纯水机 （美国Millipore 公司）， 百分之一天平 （上海梅特勒集团有限公司）。

（二） 实验方法

1.样品前处理。 称取10 g 均质试样 （精确至0.01 g） 于50 mL 塑料离心管中， 加入20 mL 乙腈，振摇1 min 后用滤纸过滤， 收集滤液， 向滤液中加入QuEChERS 提取盐包， 剧烈振荡1 min 后静置3 min。 吸取1.5 mL 上清液经mPFC 净化柱一次净化，准确吸取1.0 mL 净化液至2.0 mL 离心管中， 后进行浓缩至干， 加入75 μL 石油醚（60～90℃） 复溶。

2.高效薄层色谱成像分析。 在层析缸中加入适量展开剂， 用定量毛细管分别吸取标准溶液和样品处理溶液， 在薄层板基线处的固定位置上点样，每个点至少间隔0.7 cm， 单块板最多可点6 个点。点样结束时用电吹风机热风吹2 min， 然后将该薄层板放入层析缸中展开， 当展开剂到达溶剂前沿线时， 将薄层板取出并晾干。 将完成展开的薄层板放入显色仪中， 显色10 min 后取出， 放入成像分析仪中分析。

3.定性与定量分析。 成像分析仪中内设两种参比标样物质， 分别为20 μg/mL 氰戊菊酯和溴氰菊酯标准溶液。 根据参比标样和样品中各组分经两种展开剂处理后相对移动位置各不相同的特性， 同一样品经展开剂1 和展开剂2 分别展开， 进行二次分析来提高定性结果的准确性。 通过软件自动扫描， 得到样品中拟除虫菊酯类农药斑点的Rf值和灰度积分值。 根据目标物与参照物用同一方法所得色谱斑点的Rf值进行定性分析， 根据图谱斑点的灰度积分值进行定量分析。 一次实验可以同时检测两种不同的拟除虫菊酯类农药。

4.标准曲线。 将10 种拟除虫菊酯类农药按表1 分成5 组， 用石油醚分别配成0.5、 0.8、 1.2、1.5、 2.0 μg/mL 的混合标准工作溶液。 分析软件将薄层板分为6 通道， 用毛细管吸取标准品分别点板， 0～1 号通道为标准对照， 2～5 通道分别为不同浓度的混合标准工作溶液， 通过展开剂1 和展开剂2 展开后成像分析。

5.样品制备。 选用6 种具有代表性的蔬菜（包括简单基质大白菜、 番茄、 西葫芦， 复杂基质青菜、 空心菜、 结球甘蓝） 作为样品空白基质， 通过空白基质加标分别制备阴性样品和阳性样品。 （1）阴性样品制备。 阴性样品由36 个加标样品组成，每种蔬菜称取6 个平行样， 添加浓度为0.25 mg/kg。 （2） 阳性样品制备。 阳性样品由72 个加标样品组成， 每种蔬菜称取12 个平行样， 平均分为2 组， 每组6 个样品。 分别加入不同浓度的标准液， 一组加标浓度为0.5 mg/kg， 另一组加标浓度为1.0 mg/kg。

二、 结果与分析

（一） 一步式QuEChERS 和传统QuEChERS比较以西葫芦作为简单基质， 青菜作为复杂基质， 在添加水平为0.5 mg/kg 时， 比较了一步式QuEChERS 方法（简称本方法）和GB 23200.113-2018 《食品安全国家标准 植物源性食品中208 种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法》 中的传统QuEChERS 方法（简称传统方法）对10 种拟除虫菊酯类农药回收率的影响， 结果见表2。 由表2 可知， 对于简单基质， 本方法的回收率范围为84%～94%， GB 23200.113-2018 标准方法的回收率范围为88%～98%， RSD 均≤6%；对于复杂基质， 本方法的回收率范围为71%～111%， GB 23200.113-2018 标准方法的回收率范围为74%～100%， RSD 均小于10%， 满足实际检测要求。 两种方法的回收率差异较小， 准确度也基本一致。 但与传统方法相比， 本方法不需借助其他辅助仪器， 前处理时间可控制在10 min 以内，比标准方法更方便， 用时更短。 由此可见， 一步式QuEChERS 方法可以在较短的时间内准确地完成蔬菜中10 种拟除虫菊酯类农药的提取净化前处理。

表2 10 种拟除虫菊酯类农药的线性方程、 相关系数、 检出限

（二） 固定相的选择HPTLC 采用粒度分布很窄的微粒硅剂 （5～10 μm） 制备高效薄层板， 灵敏度和分辨率大大提高。 通常分辨率与吸附剂微粒半径的平方成反比， 涂层厚度为0.2～0.25 mm， 硅胶粉粒度为 （8±2）μm。 展开速度与吸附剂颗粒半径成正比， 故颗粒越小， 展开速度越慢， 但在分离效率提高了之后可以大大缩短展开距离。

本研究选择具有荧光背景的薄层板作为固定相进行分析， 在紫外灯照射下， 目标条带会在薄层板上猝灭形成黑斑， 无需显色剂显色[18]。 实验分别比较了3 种不同的高效薄层板（硅胶板、 中性氧化铝板和碱性氧化铝板） 的分离效果， 经展开剂上行展开后， 在254 nm 紫外灯下观察， 不同固定相分离结果见图1。 结果表明， 采用高效薄层硅胶板分离后斑点集中， 分离效果明显， 而采用中性氧化铝板和碱性氧化铝板斑点分离不明显。 因此， 选择高效薄层硅胶板作为固定相开展后续实验。

图1 不同固定相的分离效果对比

（三） 展开剂的优化为使得待测组分的Rf值在0.2～0.8 之间， 同时考虑拟除虫菊酯类农药的溶解性， 以弱极性溶剂环己烷为基础体系， 加入丙酮、 乙酸乙酯、 三氯甲烷作为调节试剂来调节展开系统的极性。 前期预实验发现， 甲氰菊酯、 氯氰菊酯和氰戊菊酯性质相近，Rf值大小相近， 较难实现分离， 而其他几种拟除虫菊酯类农药Rf值都有较大差异。 所以以分离甲氰菊酯、 氯氰菊酯和氰戊菊酯为主要目标， 比较了3 种调节试剂的分离效果，基础溶剂与调节剂的配比均为9∶1 （V∶V）， 结果见图2。 结果表明， 3 种展开系统斑点都较为清晰，其中采用环己烷-乙酸乙酯作为展开系统时， 氯氰菊酯和氰戊菊酯斑点较近且混标斑点中两者重合，未有效分离； 经环己烷-丙酮、 环己烷-三氯甲烷两种展开系统展开后， 氯氰菊酯和氰戊菊酯斑点有一定距离， 分离效果较好。

图2 不同展开系统的分离效果对比

对三氯甲烷、 环己烷、 丙酮等展开剂进行不同配比， 经大量实验， 得出两种较为理想的复合展开剂， 分别是展开剂1 （三氯甲烷-环己烷， 10∶1，V∶V） 和展开剂2 （环己烷-丙酮， 9∶1.5，V∶V），分离效果见图3。 10 种拟除虫菊酯类农药标准点斑点规整且分离明显， 表明展开剂对拟除虫菊酯类农药的检测结果无明显干扰， 分离效果佳。 实际检测中可利用展开剂2 对展开剂1 得到的分析结果进行确认， 避免假阳性的出现。 混合标准溶液按表1 中分组进行配制， 得到5 组混标， 混标经展开剂1 和展开剂2 的展开效果见图4。 如图4 表示， 1～5 组混标可两两分离且在两种展开剂下得到的展开距离各不相同， 得到两组不同的Rf值； 同组混标中的两种拟除虫菊酯类农药在展开剂1 下的展开距离差值相较于展开剂2 下的差值更小， 因而可通过在两种不同展开剂下的差异进行二次分析来提高定性的准确度。

图3 不同展开剂的薄层色谱图

图4 5 组混标的薄层色谱图

（四） 标准曲线与检出限以青菜为基质， 采用基质配标的方式考察了添加不同梯度浓度的10种拟除虫菊酯类农药标准溶液的线性范围 （0.5、0.8、 1.2、 1.5、 2.0 mg/kg） 和检出限。 以甲氰菊酯和氟胺氰菊酯为例， 线性浓度范围内的甲氰菊酯和氟胺氰菊酯的展开效果见图5。 由图5 可知， 样品通过前处理之后， 展开区基本不存在影响结果判定的杂质斑点， 杂质都集中在薄层板点样点的最上部。

图5 甲氰菊酯和氟胺氰菊酯基质加标溶液的薄层色谱图

在0.5～2.0 mg/kg 线性范围内， 以10 种农药的添加浓度与对应的积分值进行线性回归分析， 结果见表2。 由表2 可知， 10 种拟除虫菊酯类农药的线性关系良好， 相关系数均大于0.96， 检出限均为0.5 mg/kg。

（五） 准确度和精密度以加标回收率和RSD分别表征准确度和精密度， 在1 倍检出限和2 倍检出限的添加水平下进行加标回收实验， 准确度和精密度结果见表3。 结果表明， 10 种拟除虫菊酯类农药在蔬菜中的平均回收率在91.0%～123.4%之间，RSD 在7.7%～15.4%之间， 所建方法具有较好的准确度和精密度。

表3 方法的准确度和精密度（n＝6）

（六） 灵敏度与特异性灵敏度以方法在实验条件下达到实际检出限时， 检出阳性结果的阳性样品数占总阳性样品数的百分比表示； 特异性以方法在实验条件下达到实际检出限时， 检出阴性结果的阴性样品数占总阴性样品数的百分比表示。 本研究所建方法对10 种拟除虫菊酯类农药的检测灵敏度和特异性考察结果见表4。 如表4 所示， 灵敏度均大于95%， 特异性均大于94%， 假阴性率均低于5%， 假阳性率均低于6%， 符合一般快速检测产品技术评价要求。

表4 方法的灵敏度和特异性（%）

三、 结论

本研究基于改良的QuEChERS 前处理技术和高效薄层色谱法， 建立了蔬菜中10 种拟除虫菊酯类农药的快速检测方法， 将一步式QuEChERS 方法成功应用于拟除虫菊酯类农药快速检测。 方法学考察结果表明， 方法在0.5～2.0 mg/kg 范围内线性关系良好， 准确度、 精密度、 灵敏度和特异性等方面均能满足分析要求， 可实现多个样品同时检测，耗时短， 分析效率高， 45 min 内可检测8 个样品。且方法在色谱展开过程中所用的有机溶剂少， 分析成本低， 环境污染小， 适合各基层推广应用。

本文引用格式： 高猛峰， 张维谊， 梅博， 等.QuEChERS-高效薄层色谱法测定蔬菜中10 种拟除虫菊酯类农药残留 ［J］.农产品质量与安全，2023 （5）： 55-60.

GAO Mengfeng， ZHANG Weiyi， MEI Bo，et al.Simultaneous determination of ten pyrethroid pesticides in vegetables by QuEChERS coupled with high performance thin layer chromatography［J］.Quality and Safety of Agro-products， 2023 （5）： 55-60.