3种拮抗烟草疫霉及产IAA内生细菌的分离鉴定

李颖颖, 康业斌, 李成军, 李淑君

(1.河南科技大学园艺与植物保护学院,河南洛阳 471000;2.烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室/河南省农业科学院烟草研究所,河南许昌 461000)

由烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)侵染烟草引起的黒胫病在全球普遍发生,严重威胁烟草农业生产[1]。生物防治成为烟草病害防治的发展趋势[2]。内生细菌丰富多样,几乎存在于地球上所有的植物中,不少内生细菌具有促进植物生长、提高产品品质与增强植株抗病、抗逆能力的作用[3]。陈泽斌等通过培养皿发芽试验,从烟草植株中初步筛选出 4 株能提高烟草种子发芽率、促进根系生长的内生细菌,浮育苗试验发现用这些内生细菌处理过的烟苗生长发育更好[4]。雷丽萍从白肋烟 TN90 中分离出一株内生芽孢杆菌(Bacillussp.)菌株WT能显著降低烟株中的亚硝胺(TSNA)含量[5]。邢颖等发现,相比普通烟株,感染内生菌的烟草中亚硝胺类物质含量更低,烟草品质更佳[6]。梁志超等发现,用内生解淀粉芽孢杆菌制成微生物功能基质,能达到促生烟苗的效果[7]。夏体渊等发现,通过控制生物炭的不同施用量可以调整烟草内生细菌的种类和数量[8]。周燕等在黄烟上发现了能够防治烟草青枯病的内生细菌[9]。云南省烟草农业科学研究院建立了国内首个烟草内生菌资源库,保存了具有较高杀线虫活性、提高烟草种子发芽率、促进根系生长与对烟草黑胫病、空茎病、野火病等具有明显拮抗作用的内生菌菌株[10]。周岗泉等研究发现,烟草中具有抑菌作用的内生细菌几乎均来自抗病品种,抗病品种比感病品种具有更多的拮抗内生细菌[11]。目前,已经报道的烟草内生细菌有 30 多个属,51 个种[10]。不同烟草种植地区、不同气候条件和土壤类型,烟草植株体内内生细菌种类和数量存在差异。本研究报道了河南省洛阳地区烟株内生功能细菌的分离鉴定结果,旨在为烟株内生有益微生物的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试烟草植株 2021年6—9月,选择河南省洛阳市宜阳、汝阳、洛宁、嵩县等4个县区烟田,于烟草团棵期、旺长期及成熟期采集健康烟株164株,带回实验室备用。

1.1.2 供试菌株和烟草品种 烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)、茄病镰刀菌(Fusariumsolani)、轮枝镰刀菌(F.verticillioide)、异丝腐霉(Pythiumdiclinum)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、层出镰刀菌(F.proliferatum)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothide)以及烟草品种(秦烟96)均由河南科技大学植物病害分子鉴定与绿色防控实验室提供。

1.1.3 供试培养基 主要培养基有NA培养基、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基、LB液体培养基、糖醇发酵培养基、M.R培养基、淀粉水解培养基、硝酸盐还原培养基、明胶液化培养基、苯丙氨酸脱氨酶培养基、石蕊牛乳培养基、柠檬酸盐培养基、休和赖夫森二氏培养基、半固体琼脂培养基、丙二酸盐培养基[12]。

1.2 试验时间与地点

烟株样品采集工作于2021年6、7、8、9月在河南省洛阳市宜阳县石村烟草种植田、河南省洛阳市汝阳县刘家凹烟草种植田、河南省洛阳市洛宁县王村烟草种植田、河南省洛阳市嵩县流涧峪村烟草种植田进行。

其他试验部分于2021年6月至2022年12月在河南科技大学植物病害分子鉴定与绿色防控实验室进行。

1.3 试验方法

1.3.1 烟草内生细菌的分离、纯化 将根、茎、叶通过清水冲洗后自然晾干,随机称取0.4 g,依次用70%乙醇、3%次氯酸钠消毒,无菌水冲洗3次,以最后1次冲洗的无菌水涂布平板作为空白对照,检验样品表面的微生物是否消毒彻底,通过稀释涂布平板法分离[13]。

1.3.2 拮抗烟草疫霉内生细菌的筛选 (1)初筛:采用平板对峙法测定分离所得菌株对烟草疫霉的抑菌率[13]。(2)复筛:选择初筛对烟草疫霉抑菌率大于50%的内生菌株,通过菌丝生长速率法检验其发酵液对烟草疫霉的抑菌率[14]。

1.3.3 产IAA内生细菌的筛选 参照桂楚伊的方法制备吲哚-3-乙酸(IAA)标准曲线[15],利用Salkowski比色法对菌株产IAA能力进行定性、定量测定[16]。

1.3.4 内生有益细菌的鉴定 选择对烟草疫霉初筛抑菌率大于50%与菌株发酵液IAA含量在 3.7 mg/L 以上的菌株进行鉴定。(1)形态学鉴定:采用平板划线法接种待鉴定菌株于NA平板,28 ℃倒置培养3 d,至平板长出单一菌落。观察单菌落的颜色、形状、大小、黏稠度、透明度、边缘等形态特征。革兰氏染色和芽孢染色后[15],通过光学显微镜观察菌体和芽孢形态。(2)生理生化鉴定:菌株的M.R试验、淀粉水解与糖醇类发酵等生理生化指标测定参照刘丽辉等的方法进行[17]。(3)16S rDNA 序列测定:根据生工生物工程(上海)股份有限公司细菌基因组DNA试剂盒方法提取DNA作为模板,采用细菌通用引物27F、1492R进行PCR扩增[18]。为了使鉴定结果更加准确,同时选用gyrB基因引物UP-1、UP-2R进行扩增测序验证[19]。PCR扩增体系和反应条件见表1。扩增产物经过电泳检测后,送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果在GenBank(NCBI)数据库中进行BLAST比对,以同源性较高的模式菌株基因序列作为参比对象,通过MEGA 7.0软件构建系统发育树[20]。

表1 通用引物及PCR反应信息

1.3.5 细菌的抑菌谱测定 采用平板对峙培养法测定12株细菌对 7 种烟草病原菌的抑菌谱。以只接种病原真菌为空白对照,28 ℃倒置培养3～7 d,计算抑菌率。

1.3.6 细菌对烟草种子促生作用的测定 采用培养皿滤纸保湿法测定12株细菌对烟草种子萌发率的影响及促生效果[21]。将健康的烟草种子置于孢子悬浮液(1×107孢子/mL)中浸泡 16 h,整齐摆放于铺有灭菌脱脂棉和滤纸保湿的培养皿中,以无菌水浸种为空白对照,每皿30粒(5×6),重复3次。第14天统计种子萌发率、烟苗根长、茎长和总长(以种子生长节点区分根长和茎长,总长为根长与茎长之和),计算增长率。

2 结果与分析

2.1 内生细菌的分离

从164份烟株样品的根、茎及叶片中分别分离出细菌单菌落133、99、157株,依据这些菌株在NA培养基上菌落的颜色、形态等特征进行归类,共分离纯化获得206株细菌菌株。

2.2 拮抗烟草疫霉菌株的筛选

通过平板对峙法测定206株细菌对烟草疫霉的抑菌活性,抑菌率达50%以上的有24株(表2),其中菌株LYYY63-1、LYSX141的抑菌效果最好,抑菌率分别为74.79%、72.58%。菌株LYYY61-2的抑菌率为62.10%,抑菌带最大,为1.48 cm。复筛结果表明,增加拮抗菌的接种量可以明显提高菌株的抑菌效果,当PDA培养基中添加菌株发酵液至体积浓度为10%时,菌株LYYY63-1、LYRY39-1、LYSX141对烟草疫霉的抑菌率分别达到88.10%、84.55%、73.33%(表3),说明增加空间用量能有效提高菌株的抑菌作用。

表2 内生细菌菌株对烟草疫霉的平板抑制效果

表3 内生细菌菌株发酵液对烟草疫霉的抑菌效果

2.3 产IAA菌株的筛选

2.3.1 IAA标准曲线 通过IAA不同质量浓度标准品溶液与Salkowski比色计进行显色反应,用紫外分光光度计测量样品溶液在波长535 nm处的吸光度。IAA标准品质量浓度分别为10、20、30、40、50 mg/L 时,测得吸光度分别为0.238、0.659、0.993、1.326、1.685,得到标准曲线y=0.035 6x-0.088 1,r2=0.998 1(图1)。

2.3.2 IAA定性测定和定量测定 定性检测筛选出能产生IAA的细菌菌株。利用紫外分光光度计法测定菌株发酵液的吸光度, 通过IAA标准曲线计算出各菌株产IAA含量,IAA产量在7 mg/L以上的有28株(表4)。

表4 产吲哚-3-乙酸优势菌株的筛选结果

2.4 烟草内生功能细菌的鉴定

2.4.1 形态学特征 供试菌株在NA平板上划线接种,置于28 ℃条件下恒温培养3 d,大部分菌株呈现乳白色和白色,少部分呈现黄色,菌落整体上不透明,多为圆形或者近圆形。大小、表面特征和黏稠度特征存在差异。12株细菌革兰氏染色结果表明,其中5株为阳性反应,7株为阴性反应(表5)。菌体呈杆状,少数为卵球形,部分产芽孢,呈柱形。

表5 12株内生细菌的形态特征

2.4.2 生理生化鉴定 生理生化试验结果表明,12株细菌多为兼性厌氧细菌, 菌株LYRY8、LYYY63-1为厌氧性菌。柠檬酸盐利用、接触酶、明胶液化和产酸反应试验结果呈阳性,具有一定的运动性。可以利用葡萄糖、蔗糖和甘露糖,大部分能够利用石蕊产酸,菌株LYRY45利用葡萄糖时能够产气(表6)。结合《常见细菌系统鉴定手册》将11株拮抗细菌鉴定为芽孢杆菌属(Bacillusspp.),菌株LYRY45鉴定为变形杆菌属(Proteussp.)。

表6 12株内生细菌的生理生化检验结果

2.4.3 12株内生细菌16S rDNA序列分析 将测序得到的12株细菌基因序列上传至GenBank数据库(获得登录号分别为OP646622、OP646623、OP646624、OP646625、OP646626、OP503441、OP646627、OP646628、OP646629、OP646630、OP646631、OP646632),并将基因测序结果进行序列分析及同源性对比。结果表明,菌株LYRY8的基因序列与B.safensisEGI287 (MN704552.1)同源相似性为99.68%,菌株LYYY61-2和LYRY69-2与B.safensisS21 (MN062620.1)同源相似性为99.55%,菌株LYYY117与B.safensisEGI287 (MN704552.1)同源相似性为98.39%,菌株LYRY25与B.subtilisJX-2 (KX708699.1)同源相似性为99.28%,菌株LYLN27与B.subtilisH10-7 (FJ392727.1)同源相似性为99.37%,菌株LYRY39-1与B.subtilisUK19 (ON357947.1)同源相似性为97.53%,菌株LYYY63-1与B.subtilisB11 (KJ870191.1)同源相似性为98.50%,菌株LYYY63-3与B.subtilisHGUP332 (MK103123.1)同源相似性为97.81%,菌株LYSX73与B.subtilisSRCM102750 (CP028215.1)同源相似性为98.69%,菌株LYSX141与B.subtilisACHB-2 (KU867636.1)同源相似性为99.46%。构建系统发育树(图2)发现有4株细菌与沙福芽孢杆菌位于同一进化分支,亲源关系最近;另7株细菌与枯草芽孢杆菌位于同一进化分支,亲源关系最近。菌株LYRY45与ProteusmirabilisM3-1-17 (CP053681.1) 同源相似性为99.13%。构建系统发育树(图3)发现LYRY45与奇异变形杆菌位于同一进化分支。gyrB序列测定结果也与上述一致。

结合形态学鉴定、生理生化检验及16S rDNA序列分析,将YRY25、LYLN27、LYRY39-1、LYYY63-1、LYYY63-3、LYSX73、LYSX141菌株鉴定为枯草芽孢杆菌 (B.subtilis),LYRY8、LYYY61-2、LYRY69-2、 LYYY117菌株鉴定为沙福芽孢杆菌(B.safensis),均属厚壁菌门,芽孢杆菌纲,芽孢杆菌目,芽孢杆菌科,芽孢杆菌属。LYRY45菌株鉴定为奇异变形杆菌 (P.mirabilis),属变形菌门,变形菌纲,肠杆菌目,肠杆菌科,变形杆菌属。

2.5 功能细菌的抑菌谱测定

试验结果证明,12株功能细菌对7种常见的烟草病原真菌均表现出不同程度的拮抗作用,抑菌率介于0.68%～71.28%(表7),具有较好的抑菌广谱性。对比结果发现,12株细菌对轮枝镰刀菌、异丝腐霉和立枯丝核菌的拮抗效果最好,抑菌率平均值高于其他病原真菌。沙福芽孢杆菌菌株LYYY61-2、LYRY8、LYYY117对立枯丝核菌的防治效果最好,抑菌率分别为71.28%、70.95%、61.15%。

表7 12株细菌对常见烟草病原真菌的抑制作用

2.6 功能细菌对烟草种子促生作用的测定

培养皿滤纸保湿法结果显示(表8),浸种处理后,除菌株LYRY8、LYLN27、LYSX73未表现出明显促生作用外,9株细菌的萌发率、根长均高于空白对照组。菌株LYRY45促生效果显著,出芽率达到98%,促进根部生长37.76%,LYYY117菌株次之。

表8 12株细菌悬浮液浸种对种子萌发及生长的影响

3 讨论与结论

烟草中已报道的内生细菌资源包括芽孢杆菌属、微杆菌属、变形杆菌属、假单胞菌属等[6]。陈泽斌等报道芽孢杆菌是烟草内生菌的优势类群[22-23]。本研究筛选出的12株内生细菌,有11株鉴定为芽孢杆菌属,占比91.67%,与陈泽斌等的报道[22]相符。杨桃从烟株上分离出内生枯草芽孢杆菌Itb57,证实该菌株对烟草疫霉抑菌效果良好,研究发现其抑菌活性与蛋白物质有关[24]。马冠华等先后报道了枯草芽孢杆菌对烟草黑胫病、烟草青枯病具有良好的防治效果[25-27]。本试验得到的7株枯草芽孢杆菌对茄病镰刀菌、轮枝镰刀菌、异宗腐霉、立枯丝核菌以及尖孢镰刀菌均表现出明显的抑制作用。菌株LYYY63-1、LYRY39-1、LYSX141对烟草疫霉的平板抑制拮抗效果可达88.10%、84.55%和73.33%,形态和颜色特征与马冠华分离鉴定的Itb57菌落较相似[25],生理生化特征略有差异,分析这与菌落培养环境条件不同有关。

沙福芽孢杆菌作为生防内生细菌,目前已在核桃、槐树、瓜果类和木豆等植物体内发现[28-31],烟草方面相关研究甚少。焦蓉等曾在烟草种子部位发现一株具有拮抗和促生作用的沙福芽孢杆菌菌株YN201702[32]。本研究获得的沙福芽孢杆菌菌株LYRY8、LYYY117、LYYY61-2对烟草疫霉的室内抑菌率分别达到67.06%、64.72%和62.10%,菌株LYYY69-2的抑菌率为69.04%,在烟草植株的茎部、叶部均有分离发现,具备作为生防菌的良好潜力。抑菌谱试验结果说明菌株LYRY8、LYYY61-2、LYYY117针对立枯丝核菌具有显著的抑制效果。烟种经菌株LYYY117发酵液处理后,萌发率达到96.67%,较空白对照组根长、茎长及总长指标均具有明显提高。相比于室内培养,室外田间环境易受各种因素干扰影响,情况更加复杂多变,生防菌的作用效果尚需要结合盆栽或田间试验进行验证。

本研究首次于烟株体分离出奇异变形杆菌菌株LYRY45。奇异变形杆菌常作为动物体的病原菌存在[33]。试验分离得到的菌株LYRY45相比其他11株细菌产IAA含量更高,在LB液体培养基中IAA产量为11.06 mg/L。种子萌发试验的萌发率达98.00%,促进根长增长37.76%,茎长增长21.43%,总长增长33.96%,其促生效果明显高于其他菌株处理,与IAA含量测定试验结果一致,促进作用显著。内生菌促生作用的机制途径复杂,这种产生植物生长素的机制在烟株体内能否表达及对植株生长的促进作用是否稳定仍需验证研究。

本研究筛选得到的12株烟草内生细菌,经鉴定为枯草芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、奇异变形杆菌3类,对烟草疫霉具有显著的抑制作用及产IAA能力,抑菌谱广且具备一定的促生作用,具有较好的应用潜力。