蝴蝶兰WRKY57基因的克隆、亚细胞定位及响应脱落酸功能分析

朱飞雪, 程玉江, 郭 丽

(1. 河南农业职业学院园艺园林学院,河南中牟 451450; 2. 河南东宝园林绿化工程有限公司,河南郑州 451450)

脱落酸(ABA)是植物体内重要的天然激素,在植物细胞分化、休眠、组织发育等过程中发挥着至关重要的作用[1]。当植物受到外部环境胁迫时,ABA的合成、转运及分布会受到显著影响[2]。WRKY蛋白是植物中特异的转录因子家族,其特征为WRKY在蛋白质序列中存在高度保守的WRKY结构域,WRKY结构域由1个保守的核心序列WRKY-GQK和1个锌指基序组成[3]。WRKY蛋白可根据WRKY保守结构域的数量和氨基酸序列分为3型:Ⅰ型WRKY蛋白包含2个WRKY结构域,而Ⅱ、Ⅲ型WRKY皆由1个WRKY结构域组成;但不同型WRKY的锌指基序不同,在Ⅰ、Ⅱ型WRKY蛋白的C末端具有C2H2基序,而Ⅲ型的C末端则为C2HC[4]。此外,根据序列相似性,Ⅱ型分为a、b、c、d、e 5个亚型[5]。已有研究表明,WRKY转录因子在应对生物胁迫和调控植物生长发育方面发挥着重要作用,然而其对植物激素的串联反应鲜有研究涉及。

自从WRKY转录因子首次在兰科植物中被发现以来,关于WRKY基因的研究主要集中于生物学进展上,多项研究证实WRKY转录因子参与腺毛生长、种子萌发、果实成熟、叶片衰老等过程[6-8]。Raineri等研究表明,在水分胁迫下,HaWRKY76转基因株系和野生型向日葵转基因植株表现出更强的抗逆性和更高的产量[9]。王茹等发现,番茄SlWRKY6转录因子的过表达可诱导植株细胞壁螯合重金属,从而对植株重金属累积具有负调控作用[10]。低温胁迫下,马铃薯StWRKY15基因的过表达可显著提高脯氨酸、可溶性糖、总蛋白含量,降低丙二醛分泌,从而减轻寒冷胁迫对植株带来的不利影响[11]。在水稻中,OsWRKY11可被热应激和转基因诱导上调表达,从而增强水稻幼苗对高温胁迫的耐受性[12]。此外,WRKY转录因子在病害[13]、虫害[7,14-15]等生物胁迫方面亦发挥着重要作用。

兰科是最大的被子植物之一,约占被子植物总量的10%,在全世界约有750属25 000余种。目前关于兰科植物的研究主要集中在花朵发育、色素机制、菌根共生等方面[16]。随着分子生物学技术特别是高通量测序技术的广泛应用,已经探索了兰科MADS-box、MYB家族的全基因组特征和响应环境变化的功能分析[17]。蝴蝶兰(Phalaenopsisaphrodite)是我国栽培的重要兰科植物,具有较高的观赏价值和经济价值。然而,该品种的过度挖取和生态环境恶化,使得蝴蝶兰种质资源和生存环境维护日趋严峻[18]。WRKY家族是植物中最大的超家族之一,然而对兰科植物WRKY转录因子的结构及功能却知之甚少。基于此,本研究从蝴蝶兰中克隆并分析了PaWRKY57基因,探索了该基因的理化特性、亚细胞定位、组织表达、响应脱落酸的功能分析,旨在为蝴蝶兰的育种和遗传改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料处理

试验于2021年6—10月在河南农业职业学院人工气候室中进行。蝴蝶兰品种为满天红,为河南东宝绿化工程园林有限公司培养的二年生组培苗。供试野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)种子为拟南芥Col-0生态型,过表达拟南芥种子为PaWRKY57转化型,供试烟草品种为本氏烟草(Nicotianabenthamiana),购自福州爱若莎生物科技有限公司。供试脱落酸(ABA,C15H20O4)购自Sigma-Aldrich化工试剂公司。供试培养基质为泥炭、蛭石按体积比2 ∶ 1复配。

将二年生的蝴蝶兰组培苗置于75%相对湿度的人工气候室中培养,光—暗周期为16 h—8 h,光照度为150 μmol/(m2·s),昼、夜温度分别为26、22 ℃;并在0、2、4、8、12、24、48 h取样保存于 -80 ℃ 环境。用于瞬时转化的本氏烟草培养环境同蝴蝶兰组培苗。

将野生Col-0生态型拟南芥种子置于装满培养基质的钵体中,标记为WT,基质含水量为75%,转移至人工气候室中。相关过表达转化品系培养方式同Col-0生态型。对于过表达拟南芥的外源脱落酸处理:采用10 mmol/L ABA喷洒拟南芥的叶子直至滴落,并在处理后0、12、24、48 h取样。

1.2 WRKY基因克隆及序列分析

1.2.1WRKY基因的克隆 采用MiniBEST Plant RNA 提取试剂盒[TaKaRa,宝生物工程(大连)有限公司]对蝴蝶兰进行总RNA提取,采用PrimeScript RT Master Mix试剂盒[TaKaRa,宝生物工程(大连)有限公司]逆转录合成第一链cDNA,将cDNA稀释100倍以适合PCR反应,引物由Oligo5.0软件根据PaWRKY57基因序列设计(表1),并通过RT-PCR克隆全长PaWRKY57基因。PCR反应程序如下:94 ℃ 3 min;98 ℃ 10 s,56 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,32个循环;72 ℃ 5 min。PCR产物采用2%琼脂糖凝胶电泳检测其质量和纯度。将扩增的片段纯化并连接到pEASYBlunt载体,然后将该载体转化到Trans5α细胞中,并测试其克隆阳性反应。

表1 qRT-PCR引物序列信息

1.2.2WRKY基因的序列分析 通过Expasy系统(http://web.expasy.org/compute_pi/)在线预测氨基酸序列的物理和化学性质,包括分子量和等电点[19]。使用WOLF PSORT (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)对蛋白质亚细胞定位进行在线预测。使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)对保守域进行在线预测。多序列比对通过Clustal W (http://www.clustal.org/clustal2/)和DNAMAN5.0软件(Lynnon Biosoft,https://www.lynnon.com/dnaman.html)进行。AtWRKY和OsWRKY转录因子的氨基酸序列从TAIR 9.0 (http://www.arabidopsis.org/index.jsp)和植物转录因子数据库(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)下载。采用MEGA 7.0软件的邻接法(NJ)构架系统发育树,bootstrap设置为1 000[20]。

1.3 亚细胞定位测定

利用在线软件Plant-mPLoc 9.0(http://linux1.softberry.com/all.htm)和Cell-PLoc 2.0软件[21](http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)对蝴蝶兰PaWRKY57蛋白进行亚细胞定位。根据PaWRKY57序列设计不含有终止密码子(ORF)的XbaI/SmaI酶切位点特异性引物(表1),并以蝴蝶兰cDNA为模板进行PCR扩增,利用双酶切技术(NEB)将产物与pBI121-绿色荧光蛋白(GFP)载体用T3连接酶连接,最终构建pBI121-GFP ∶PaWRKY57融合表达载体。将新鲜的表达载体转化到根癌农杆菌菌株GV3101中,5 000 r/min离心10 min,弃上清,在沉淀物中加入新鲜的烟草浸润缓冲液(0.15 μmol/L乙酰丁香酮、10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES(吗啉乙磺酸),pH值为5.6),最终D600 nm调节为0.8。室温静置2 h后接种至5叶龄的健康本式烟叶表皮。采用共聚焦激光扫描显微镜(LSM710,Carl Zeiss,Jena,德国)观察。

1.4 实时定量PCR分析

采用同基因克隆方式提取植物RNA,合成cDNA,使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)在Step One Plus实时PCR系统(Thermo Fisher,Waltham,MA,美国)上进行RT-qPCR分析。反应程序如下:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,40个循环。在分析PaWRKY57的表达水平时,使用蝴蝶兰的18S-1300作为内参基因(表1)。qRT-PCR结果采用2-△△CT算法进行相对表达量分析。

1.5 PaWRKY57的拟南芥植株转化

pBI121-35S ∶PaWRKY57通过根癌农杆菌介导的花朵浸泡法转化拟南芥[13]。感染拟南芥花朵45～60 s后,在黑暗中培养20 h,在含有50 mg/L卡那霉素(C18H38N4O15S)的MS培养基上筛选转基因种子,并将传代植物用于进一步试验。

1.6 转化植株叶绿素含量及内源性技术含量测定

叶绿素含量(叶绿素a、叶绿素b)测定皆采用乙醇丙酮浸提法,采用紫外分光光度计(UV-1800,上海美谱达仪器有限公司)在663、646 nm处测定,具体步骤参照李合生的方法[22]。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定拟南芥叶片中内源激素脱落酸(ABA)、油菜素内酯(BR)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)的含量,具体步骤参考Xu等所述[23]。

1.7 数据处理与统计分析

采用Microsoft Excel 2020对试验数据进行整理,采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析(ANOVA),采用邓肯氏多重比较进行统计分析(α=0.05),采用Origin 2022进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 蝴蝶兰PaWRKY57基因克隆及蛋白质理化性质分析

以蝴蝶兰cDNA为模板用PaWRKY57的特异性引物PaWRKY57-F/R进行PCR扩增,然后采用2%琼脂糖凝胶电泳检测,得到全长2 049 bp的特异性条带(图1-A)。PaWRKY57具有1个开放阅读框(ORF),编码682个氨基酸。利用Expasy在线工具预测结果表明,PaWRKY57蛋白的理论等电点为6.17,分子质量为76 416.43 ku,不稳定指数为45.24,脂肪系数为45.79,平均亲水性系数为 -0.906,显示PaWRKY57蛋白是一种不稳定的亲水蛋白。二级结构由19.50%的α-螺旋、15.25%延伸链、4.84%β-转角和60.41%的无规则卷曲结构组成(图1-B)。

2.2 蝴蝶兰PaWRKY57基因序列和系统发育树分析

根据SMART在线工具分析,选取与PaWRKY57同源植物的WRKY保守结构域构建系统发育树。结果表明,PaWRKY57与WRKY家族Ⅲ型的水稻OsWRKY45,拟南芥的AtWRKY30、AtWRKY41、AtWRKY53、AtWRKY70进行序列对比,发现其皆具有WRKY家族典型的“WRKYGQK”域,表明PaWRKY57属于Ⅲ型家族(图2-A)。为进一步确定PaWRKY57的分类地位,采用MEGA 7.0软件对WRKY之间的进化关系进行系统发育树分析,结果显示13个蝴蝶兰WRKY转录因子分别属于Ⅲ型(PaWRKY70、PaWRKY57、PaWRKY53)、Ⅰ型(PaWRKY2、PaWRKY3、PaWRKY24、PaWRKY4)、Ⅱa型(PaWRKY40)、Ⅱb型(PaWRKY31)、Ⅱc型(PaWRKY49)、Ⅱd型(PaWRKY21、PaWRKY11)、Ⅱe型(PaWRKY65)。总而言之,确定PaWRKY57属于Ⅲ型亚家族(图2-B)。

2.3 PaWRKY57在不同组织和ABA处理下的叶片表达模式

基因表达模式通常与基因功能密切相关。为了更好地了解PaWRKY57的功能,分析了其在蝴蝶兰不同组织(根系、假鳞茎、叶片、花朵)中的表达水平。结果表明,PaWRKY57基因在所有组织中都有阳性表达,但在这4个器官中表现出不同的表达水平,其中在假鳞茎中表达水平最低,在叶片中相对表达量最高(图3-A),表明PaWRKY57与叶片发育最为相关。作为一种植物激素反应因子,PaWRKY57对外源性脱落酸反应强烈,喷施ABA后PaWRKY57的表达水平显著增加,并在处理后2 h达到峰值,而其在12 h的表达水平与2 h相当,此后急剧下降(图3-B),这种“升—降—升—降”的表达模式表明PaWRKY57与外源脱落酸之间存在较为复杂的调控关系。

2.4 PaWRKY57的亚细胞定位

为了在蛋白质水平上探索PaWRKY57在细胞中的可能驻位点,借助在线分析工具WoLF PSORT预测了PaWRKY57蛋白的分布位置。如图4所示,PaWRKY57可能存在于细胞核中;为了确定PaWRKY57的亚细胞准确位置,构建了一个PaWRKY57 ∶ GFP融合蛋白,通过农杆菌介导浸润在本氏烟草中瞬时表达。结果表明,在激光共聚焦显微镜下,细胞核DNA被二脒基-2-苯基吲哚的蓝色荧光(DAPI)染色,PaWRKY57 ∶ GFP绿色荧光与蓝色荧光大部分重叠,表明PaWRKY57位于细胞核内。

2.5 过表达PaWRKY57及响应ABA处理的表型分析

选择来自T2代的独立转基因系进行表型观察。通过观察拟南芥的整个生长周期,发现过表达PaWRKY57的转基因植株比野生生态型(WT)植株开花更早(图5-A),同时叶片衰老黄化更迅速(图5-B、图5-C),喷施ABA进一步加快了叶片的衰老;即相同培养周期内,过表达PaWRKY57或过表达喷施ABA其叶形无明显变化,但叶黄化更明显。为此测定了植株叶片叶绿素含量,结果表明,PaWRKY57过表达以及喷施ABA条件下均显著降低了拟南芥叶片叶绿素a、叶绿素b含量(图5-D～E)。在叶绿素a与叶绿素b含量比值中,转基因与野生型拟南芥无明显差异,且均显著低于 ABA+PaWRKY57处理(图5-G)。综上,过表达PaWRKY57使植株生长史时间缩短,在此基础上喷施ABA则加速叶片衰老。

2.6 ABA处理下过表达拟南芥叶片激素变化分析

由图6所示,在拟南芥的叶片中检测到了内源激素,包括脱落酸、赤霉素、油菜素内酯、吲哚乙酸。结果显示,脱落酸喷施处理下,转化拟南芥中的ABA、GAs含量呈相同变化趋势,即随着脱落酸喷施处理时间的延长,ABA、GAs含量呈先升高后降低的趋势,脱落酸处理后各处理ABA、GAs含量均表现为ABA+PaWRKY57>PaWRKY57>WT,且ABA+PaWRKY57均在处理后12 h出现峰值,此时PaWRKY57、ABA+PaWRKY57、WT间两两均差异显著(图6-A、图6-B)。而在脱落酸喷施处理后,各处理BR含量均呈上升趋势,且各处理BR含量均呈WT>PaWRKY57>ABA+PaWRKY57(图6-C)。IAA含量与BR含量存在相反变化趋势,即随着处理时间延长,IAA含量均呈下降趋势,但同时各处理IAA含量均呈WT>PaWRKY57>ABA+PaWRKY57(图6-D)。

3 讨论

蝴蝶兰为兰科(Orchidaceae)蝴蝶兰属(Phalaenopsis)多年生观赏性草本植物,蝴蝶兰以其花姿优美、叶色翠绿、香气馥郁、叶艺优雅等特点深受园艺爱好者喜爱[24]。本研究从蝴蝶兰中克隆得到PaWRKY57蛋白,生物学信息表明:PaWRKY57理论等电点为6.17,分子质量为76 416.43 ku,脂肪系数为45.79,且不稳定指数大于40(45.24)、平均亲水性系数为负值(-0.906)。根据Expasy系统标准判别显示,PaWRKY57蛋白是一种不稳定的亲水蛋白[19]。

本研究序列对比分析表明,蝴蝶兰WRKY蛋白存在完整的WRKYGQK序列。前人研究发现不同植物WRKY转录因子的基序保守序列不同,而被子植物进化而来的WRKY蛋白发生突变、存在大概率事件[25]。然而,本研究中PaWRKY57结构域的核心序列不包含突变序列(图2-A),表明PaWRKY57结构域高度保守且其氨基酸序列在进化过程中没有发生大量变化。系统发育分析显示PaWRKY57、AtWRKY53等隶属于WRKY转录因子家族的Ⅲ型家族;而PaWRKY57、OsWRKY47同属一个小分支中,说明两者在功能上可能与水稻OsWRKY47相似。基于双酶切技术构建pBI121-GFP ∶ PaWRKY57融合表达载体,双荧光染色分析显示在本氏烟叶叶片中PaWRKY57存在于细胞核内。

基因表达模式是反映基因功能表达导向的重要指标,在植物组织中高表达的WRKY家族往往主导该组织的生长发育[26]。如编码拟南芥WRKY转录因子的TESTA GLABRA2(TTG2)早期存在于种皮中,而进入生长期后则主要在叶片中表达[27]。拟南芥WRKY转录因子家族的37个成员中有32个存在于叶片表达域中,表明WRKY在叶细胞成熟中发挥特殊作用[28]。本研究中,组织表达分析表明,PaWRKY57在根系、假鳞茎、叶片、花序中均有表达,但在叶片中的表达水平显著高于其他组织,表明其在叶片相关生理调控中扮演着重要角色。脱落酸喷施处理下叶片PaWRKY57表现出“升—降—升—降”的表达模式,同时在喷施ABA后PaWRKY57基因在2、12 h具有最高的表达水平;双峰的表达模式意味着ABA在诱导PaWRKY57的过程中可能存在多激素潮汐式的波动影响[29]。

WRKY转录因子在植物生长发育中的作用已被众多研究证实,最新的研究发现WRKY在植物叶片衰老、矮化等表型的形态建成方面起着关键作用[30]。一些研究表明,拟南芥AtWRKY53在叶片衰老早期显著上调,其在转基因拟南芥植物中的过表达加速了叶片衰老进程,而沉默AtWRKY53则延缓了叶片衰老[31]。Besseau等研究发现,敲除AtWRKY54、AtWRKY70的双突变体植株衰老更快[32]。为进一步研究PaWRKY57转录因子的功能,通过花浸泡法获得过表达PaWRKY57植株,与WT拟南芥相比,同一培养期内,过表达PaWRKY57的转基因植物开花提前且叶片黄化明显,表明该基因的过表达可能正调控植物的衰老过程。

ABA是WRKY调控网络中的关键节点之一,在转录信号通路中充当催化剂或抑制剂[33]。茶树的CsWRKY2基因在叶片中的表达量较高,ABA信号通路通过调控CsWRKY2基因在植物对寒冷和干旱胁迫的响应中发挥重要作用[34]。铁皮石斛的DoWRKY5抑制ABI5基因响应ABA的表达,并与ABAR调节因子负调控ABA信号转导通路[35]。本研究中,在转基因植株上喷施ABA,转基因植株叶片黄化加剧、叶绿素a/b含量比值更高;此外,液相色谱分析显示,喷施ABA条件下过表达植株抑生型激素(ABA、GAs)含量更高,而促生长激素(BR、IAA)含量更低。表明PaWRKY57是一个衰老基因且对ABA反应敏感,ABA作为促进剂正向调控着PaWRKY57的功能表达。

4 结论

本研究表明,蝴蝶兰PaWRKY57是一种不稳定的亲水性蛋白,具有一个开放阅读框(ORF),编码682个氨基酸。亚细胞定位显示,PaWRKY57蛋白位于细胞核中,根据其预测的亚细胞定位可能在细胞内发挥作用。结构域分析和同源性比较表明,PaWRKY57蛋白具有WRKYGQK结构域,属于WRKY家族Ⅲ型家族,系统发育分析表明PaWRKY57与水稻OsWRKY47在生物学功能上密切相关。实时荧光PCR分析显示,PaWRKY57在根系、假鳞茎、叶片、花序中表达,在叶片中表达量最高,且在ABA处理下波动较大。与野生型拟南芥品系(WT)相比,PaWRKY57过表达品系的生育周期缩短、叶片黄化严重、叶绿素含量降低、促生型植物激素含量降低、抑生型植物激素含量增加。综上,PaWRKY57是一个响应ABA信号的转录因子,可能参与了ABA信号介导调控的蝴蝶兰衰老过程。期待研究结果可为进一步研究PaWRKY57的功能和为未来蝴蝶兰的遗传改良与培育提供理论依据。