凝集素及其抗病毒功能研究进展

刘 帅, 贾赵东, 谢一芝, 马佩勇, 禹 阳, 张 铅, 边小峰

(江苏省农业科学院粮食作物研究所,江苏南京 210014)

凝集素是一类具有特殊分子结构的蛋白质,通常具有识别和结合碳水化合物的能力,并且在不改变碳水化合物部分的情况下具有特异性和可逆性[1]。1888年,Stillmark报道了第一种凝集素——蓖麻毒素(Ricin),是从蓖麻(RicinuscommunisL.)种子中提取的有毒蛋白质[2]。1975年,Becker等报道了刀豆凝集素(ConA)的分子结构和生物功能,就此将凝集素的研究带入一个具有发展潜力的新领域[2]。基于凝集素对特异碳水化合物的识别与结合特性,研究人员发现凝集素不仅在信号传导、免疫反应、植物防御等方面发挥了重要作用,同时具有抗病虫害、抗病毒病、诱导细胞凋亡等能力,在防虫抗病、生物制药、医学检测等方面具有十分广阔的应用前景,尤其是凝集素抗各类病毒的研究越来越受到人们的重视。

1 凝集素的分类

目前,研究者陆续鉴定出超过了1 000多种凝集素[2]。起初,van Damme等根据亚基结构的特异性将凝集素分为了4大类,分别是嵌合凝集素、超凝集素、全凝集素及部分凝集素[1]。从20世纪70年代开始,人们对凝集素的研究主要集中在蛋白质的特性及其与糖结合的特异性上,因此,凝集素又被分为:N-乙酰氨基半乳糖凝集素、D-甘露糖或D-葡萄糖凝集素、N-乙酰氨基葡萄糖凝集素、D-半乳糖凝集素、L-岩藻糖凝集素及唾液酸凝集素[3],其中,只有唾液酸凝集素中是不包括植物凝集素的。虽然这种分类有一定的实际用途,但很快发现这类分类方式很难维持下去。随着越来越多的凝集素被发现,凝集素的分类也在不断变化,并且更加复杂。1998年,在综合分析植物凝集素序列的基础上建立了一个系统,将所有植物凝集素的大部分划分为7个结构和进化相关的蛋白质家族。然而,随着现代分子生物学技术的深入发展,这种分类方式已不能完全覆盖所有植物凝集素。因此,目前大家最认可的凝集素或植物凝集素分类方式是依据序列相似性及其之间的进化关系进行的分类,主要包括12个家族[4-6],分别为双孢蘑菇家族(ABA families),具有双孢蘑菇同源结构域(Agaricusbisporushomolog domain),代表物种有双孢蘑菇[7]、沙雷氏菌[8];苋属植物凝集素家族(amaranthins families),具有苋属植物结构域(amaranthins domain),代表物种有千穗谷[9]、尾穗苋[10];几丁质酶相关蛋白家族(CRA families),具有几丁质酶同源结构域(homolog of class V chitinases domain),代表物种有苦瓜[11];雪花莲家族(Galanthusnivalisagglutinin families)具有雪花莲结构域(Galanthusnivalisagglutinin domain),代表物种有雪花莲[12]、黄精[13-14]、朱顶红[15-16]、对叶兰[17-20]、火烧兰[16-19];卫欧矛家族(Euonymuseuropaeusfamilies)具有卫欧矛凝集素结构域(Euonymuseuropaeuslectins domain),代表物种有大果卫矛[14,21];蓝藻凝集素家族(Cyanovirin families)具有蓝藻凝集素结构域(Cyanovirin domain),代表物种有蓝藻[22-23];豆科植物家族(Legume families)具有豆科凝集素结构域(Legume domain),代表物种有苜蓿[24];橡胶蛋白家族(Hevein families),具有橡胶凝集素结构域(Hevein domain),代表物种有橡胶树[25]、辣木[26]、马铃薯[27];具有赖氨酸基序的蛋白(Lysin Motif families),具有赖氨酸基序的凝集素结构域(Lys M domain),代表物种有蒺藜状苜蓿[28];烟草凝集素家族(Nictaba-like families),具有烟草凝集素结构域(Nictaba-like domain),代表物种有烟草[29];蓖麻毒蛋白-B家族(Ricin-B families),具有蓖麻毒蛋白-B结构域(Ricin-B domain),代表物种有蓖麻[30]、荨麻[14,21,31-32]、放线菌[33]、豇豆[34];木菠萝家族(Jacalin families),具有木菠萝凝集素结构域(Jacalin domain),代表物种有水稻[35]、小麦[36]、大麦[37-38]、甘薯[39]、菠萝蜜[40]、花萼草[41]、红藻[36,42-50]等(表1)。

表1 凝集素依据序列相似性及其之间的进化关系分类

2 凝集素抗病毒功能

与特异碳水化合物结合的特性是凝集素具有抗病毒能力的主要原因[16,49,54-55]。凝集素抗病毒活性主要是通过结合存在于病毒包膜糖蛋白上的聚糖来阻止病毒传播和渗透,或通过与病毒表面的聚糖产生交联,阻止受体与其相互作用。那是否意味着不同凝集素抗病毒活性与其结合不同种类糖基的特异性相关?通过整理研究发现,大多数被证实具有抗病毒活性的凝集素均能结合甘露糖,如红藻凝集素、兰花凝集素和朱顶红混合凝集等;仅有少部分是结合N-乙酰氨基葡萄糖(如大果卫矛凝集素等)和N-乙酰氨基半乳糖(如麒麟菜凝集素等);也有凝集素具有多种糖结合活性,如菠萝蜜凝集素可同时识别D-半乳糖和N-乙酰氨基半乳糖;而其他糖结合活性的凝集素抗病毒活性研究尚未报道。因此,依靠与不同糖结合活性对凝集素抗病毒活性进行分类的方式并不合适。

由于基因工程技术的不断发展,基于亚基结构特异性分类的方式已不再适用于凝集素,因此,笔者重点关注了基于同源性分类的模式下,不同家族抗病毒活性的分布。通过研究发现,基于同源性分类的凝集素对病毒的抗性并不一致,如红藻凝集素(GRFT)和木菠萝凝集素(Jacalin)均属于木菠萝家族,具有Jacalin domain,但GRFT可抗PRRSV、HCV、JEV、HIV、HSV等多种病毒[36,42-48,50],而木菠萝凝集素只被证实可抑制HIV病毒[14,16,17,49,51](表2)。同样,不同家族的凝集素也可能具有相同抗病毒功能,如豆科植物家族中的兰花凝集素(CA)[14,15,17-20]与蓖麻毒蛋白-B家族中的荨麻属凝集素(UDA)[14,21,31,32]。

表2 凝集素抗病毒功能

综上所述,目前对凝集素的分类都无法对应在抗病毒的活性上,这极大地限制了研究人员对不同凝集素抗病毒活性的研究。因此,笔者将通过凝集素的抗病毒机制来分析这些凝集素抗病毒能力的关联性。

3 凝集素抗病毒的作用机制

3.1 红藻凝集素抗病毒机制

红藻凝集素(Griffithsin,GRFT)是一种从海洋红藻(Griffithsiasp.)中分离的高甘露聚糖结合凝集素,被认为是迄今为止最有效的HIV感染抑制剂[73]。该蛋白包含121个氨基酸,折叠成稳定的结构域交换的同二聚体,以高甘露寡糖末端的甘露糖残基为靶点,每个同源二聚体共有6个碳水化合物结合位点[74-75],这可能也是其高效抗各种病毒的原因之一。由表2可知,GRFT制剂是目前研究最为广泛的抗病毒药物,它可抗PRRSV、HIV、HCV、JEV及HSV等多种病毒。其中,GRFT使HIV-1的失活几乎在接触病毒后立即发生[76];首先,GRFT通过选择性结合病毒包膜糖蛋白上富含甘露糖的聚糖gp120来抑制HIV与淋巴细胞表面的CD4结合[50,77-78];同时,GRFT还可抑制树突状细胞(DC-SIGN)与HIV-1的结合,从而防止病毒侵染靶细胞[1,73]。而GRFT作用于丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)生命周期的早期阶段,通过干预病毒包膜蛋白E2和病毒受体CD81之间的相互作用,以一种基因型独立的方式发挥作用[43]。GRFT还能够抑制SARS-CoV,但与前2种识别蛋白不同的是,GRFT结合SARS-CoV表面糖蛋白S,但不影响病毒识别Vero细胞表面受体[57]。另外,GRFT还可通过阻断细胞间的扩散来抑制HSV-2进入后的感染,但不影响病毒入侵细胞[79]。也有研究显示,GRFT通过与HPV受体整合素α6结合,从而抑制HPV的内化阶段[47-48]。目前,最新研究表明,GRFT抗病毒的途径也有多种,但最主要的还是通过与囊膜病毒表面的糖蛋白结合,进而抑制病毒感染传播[80]。对GRFT安全性进一步研究表明,尽管它可以结合人的鳞状上皮细胞和外周血单核细胞,但是细胞和组织在GRFT浸染时未表现出显著的炎症反应,且GRFT保持了抗病毒活性。因此,GRFT是目前临床上用于预防多种病毒的主要凝集素候选药物[54]。

3.2 蓝藻凝集素抗病毒机制

蓝藻凝集素(Cyanovirin-N,CV-N)首次是从蓝藻Nostocellipsosporum中分离得到的凝集素。CV-N 由101个氨基酸组成,分子量为11 ku,含有2个碳水化合物结合位点,可特异识别α-1,2-高甘露糖的末端[81]。CV-N抑制病毒复制的方式有干扰细胞与细胞膜融合、干扰病毒与细胞的吸附以及抑制病毒在细胞与细胞之间的传播,其中最主要的方式是阻断感染病毒的细胞对其他细胞的侵染。研究表明,CV-N在低纳米摩尔范围内对 HIV-1 和HIV-2、猿类免疫缺陷病毒(SIV)和H1N1[82]等多种病毒具有广泛的中和活性,并且对HCV、HSV-1、HSV-2及Ebola等病毒也具有一定的抑制作用[83-85]。而CV-N这种广泛的抗病毒活性是由于对gp120具有高亲和性[86]。由于CV-N的2个碳水化合物结合位点与Man9GlcNAc2具有极高的亲和性,而Man9和Man8是gp120上常见的高甘露糖末端,因此,CV-N很容易与gp120结合从而抑制病毒与初级受体细胞CD4结合[87-88]。然而,CV-N在抑制病毒的过程中还会导致细胞活化,产生有丝分裂原性,并增加人类PMBC细胞激素的产生[89],这使得CV-N在抗病毒应用上存在一定的限制。

3.3 微囊藻凝集素抗病毒机制

微囊藻凝集素(Microvirin,MVN)是一种从铜绿微囊藻(Nostocellipsosporum)中分离得到凝集素,含有108个氨基酸,分子量为14.3 ku。MVN与 CV-N 均属于Cyanovirin家族蛋白,有33%的同一性,且MVN保留了相似的糖水化合物结合结构,因此MVN也能特异识别α-1,2-高甘露糖的末端[90]。与CV-N一样,低纳米摩尔浓度的MVN能够广泛地中和HIV-1的病毒株,同时可抑制 HIV-1 与初级受体细胞CD4结合。但MVN在溶液中的表现形式是单体,并且其仅有1个碳水化合物结合位点可识别α-1,2-甘露糖末端,由于其不能形成二聚体结构,因此,仅能识别Man8GlcNAc2而不能识别更复杂的寡糖结构[91]。研究显示,MVN对HIV-1的抑制与CV-N具有同样的效力,但毒性比CV-N低50倍,因此是一种非常有发展潜力的抗病毒凝集素[69]。

3.4 雪花莲凝集素抗病毒机制

雪花莲凝集素(Galanthusnivalisagglutinin,GNA)最初是从雪花莲(snowdrop bulbs)中分离出来的凝集素,GNA是由4个单体非共价结合组成的四聚体(50 ku),每个单体12.5 ku,其特殊的空间结构使得GNA对Manα(1-3)寡核苷酸具有特异的亲和性,而对单糖的结合能力较弱[92-94]。目前,大多数抗HIV病毒的凝集素来源于GNA家族,如黄精凝集素PCL、朱顶红混合凝集素HHA、对叶兰凝集素LOA、火烧兰凝集素EHA等[95-100]。GNA抑制病毒的方式主要有2种:(1)阻断病毒进入且融合目标细胞。GNA通过与gp120结合导致空间位阻,从而阻止与共受体的进一步相互作用,阻断病毒进入/融合到靶细胞[95,101-102]。(2)阻断病毒的传播。阻止感染病毒的细胞与未感染的细胞结合,抑制树突状细胞引起的HIV感染[102-103]。

3.5 香蕉凝集素抗病毒机制

香蕉凝集素(banana lectin,BanLec)是从香蕉果实中分离出的凝集素,是Jacalin相关凝集素家族的一员,对高甘露糖结构也有亲和力。天然的香蕉凝集素是由2个15 ku的相同亚基组成的二聚体,亚基含有141个氨基酸[104]和2个糖结合位点[105]。研究表明,IC50值在低纳米摩尔范围内,BanLec对不同取向的HIV-1分离株具有体外抑制作用。与上述其他碳水化合物结合蛋白类似,BanLec通过与高度糖基化的gp120上的高甘露糖结构结合,以浓度依赖性的方式抑制HIV感染,从而防止病毒附着在细胞上。Swanson等也报道了BanLec是小鼠T细胞的一种有效的有丝分裂原,然而有趣的是,BanLec糖结合位点突变后显著降低了其有丝分裂活性,但不影响其对HIV的中和作用[52]。因此,该凝集素也被作为一个有潜力的HIV病毒抑制剂被开发。

3.6 其他凝集素抗病毒机制

除上述几种研究比较广泛的凝集素,目前,越来越多的凝集素被证明具有抗病毒活性,但它们的抗病毒强度与生物毒性并不一致,而这些差异与他们的空间结构有着很大关系。如,蓖麻毒蛋白-B家族中的放线菌素(Actinohivin,AH)也是一种抗HIV的凝集素,从放线菌Longisporaalbida的培养液中分离得到[106]。该蛋白是一个分子量为12.5 ku的单一多肽,含有114个氨基酸,形成3个具有 LD-QXW 的基序[107-108],这一特异性使得AH结合多种高甘露糖型聚糖[89]。与CV-N不同的是,AH不表现出细胞病变或有丝分裂的影响,并且其抗病毒活性十分稳定[33]。麻毒蛋白-B家族中荨麻凝集素UDA也是一种广泛的抗病毒凝集素,其对冠状病毒、HIV、CMV、RS、H1N1及SARS-COV等多种病毒均有抑制作用[14,21,31]。而在各类凝集素中,雪花莲家族凝集素的抗病毒能力尤为突出。许多研究成果表明,该家族对于多种病毒均具有较好的抗性,如朱顶兰凝集素[109]。在抗HIV的过程中,朱顶兰凝集素能通过截断传染源,干扰传播途径,及有效地清除感染HIV细胞等方式抑制多种HIV变异株系[110]。雪花莲家族中的多个凝集素还能与HINI病毒高效结合,在预防和治疗流感病毒方面具有较好的应用前景[111]。一些大型真菌中的凝集素也具有抗病毒功能,如猴头菇、双孢蘑菇、美味牛肝菌、蛹虫草、红菇中提取的凝集素能显著消减HIV-1逆转录酶的转录活性,从而抑制病毒增殖,达抗病毒的效果[112-115];此外,榆黄蘑凝集素还有抗人类疾病病毒的活性,体外试验表明,榆黄蘑凝集素对乙肝病毒的活性有显著影响[116]。当然,现在也有许多凝集素家族的蛋白其抗病毒活性及抗病毒机理仍是未知,需要进一步探索、开发与研究。

4 凝集素抗病毒功能的应用进展

根据病毒寄生的宿主不同,通常把病毒分为植物病毒、动物病毒和细菌病毒(噬菌体)。目前,凝集素抗病毒功能的研究主要集中在动物病毒,而抗植物病毒的研究却很少,主要是因为植物病毒没有包膜结构(包膜结构大都包含病毒糖蛋白),而凝集素抗病毒功能主要是由于其与碳水化合物的特异性结合。

4.1 抗动物病毒

由于临床应用的重要性及潜在价值,目前,大多数凝集素抗病毒研究主要集中在HIV上。然而,基于其可靶向许多包膜病毒表面糖基化蛋白的作用机制,抗HIV凝集素已被广泛用来评估其对其他包膜病毒的作用。如丙型肝炎病毒HCV,20%感染HIV的患者也会感染HCV[117]。HCV有2种高度糖基化的糖蛋白,包括E1和E2[118],其中,许多糖基化位点是高甘露糖型聚糖[119]。目前,GRFT已被证明可在体内减轻小鼠感染HCV的症状[43,44];也有研究表明,CV-N、微囊藻凝集素(MVL)和雪花莲凝集素(GNA)等可体外抑制HCV。可能是由于存在不同而复杂的作用模式,这些凝集素抗HCV的效力也不相同[59,120]。再如流感病毒,来自红藻Kappaphycusalvarezii的凝集素(KAA-2)通过直接结合病毒包膜上的血凝素(HA)进入宿主细胞干扰病毒,从而抑制多种流感毒株的感染[65]。类似地,从绿藻Boodleacoacta(BCA)中提取凝集素通过直接结合包括H1N1-2009在内的多个毒株的HA,发挥了强大的抗流感作用[65];此外其他凝集素,包括ConA、HHA等,在体外被证明可以抑制人类流感病毒[121]。SARS等冠状类病毒是目前危害人类健康最严重的病毒之一,而GRFT可以通过特异性结合SARS等冠状病毒(SARS-CoV)的刺突糖蛋白,在体外和体内预防SARS等冠状病毒的感染[42,122]。中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)是另一种高致病性人类冠状病毒,GRFT可在MERS-CoV感染初期预防体外感染从而抑制病毒[45]。此外,凝集素HHA、GNA、CA和UDA在体外和/或体内均显示出对冠状病毒的抗病毒活性[17,31,123]。因此,凝集素可被纳入对抗SARS等冠状病毒感染的抗病毒策略中[124]。

也有研究表明,凝集素同样可抑制无包膜的动物病毒,如吐丝蜘蛛凝集素(AEL)对包膜的呼吸道合胞病毒有抗病毒作用;也对非包膜的病毒柯萨奇病毒B4有抗病毒作用。这表明凝集素可能也会针对其他病毒成分,而不是表面糖缀合物[125]。

4.2 抗植物病毒

植物病毒没有包膜以及包膜蛋白上的聚糖,研究人员认为凝集素无法作用到植物病毒上,因此凝集素不能抑制植物病毒。近年来研究表明,凝集素同样也能抑制植物病毒,凝集素可与细胞壁上的糖蛋白或者细胞外聚糖相互作用,间接的抵御植物病毒的入侵。如一些豆科凝集素对细胞壁的胞壁肽聚糖极其敏感,反应后可阻断一些病毒的入侵;在一定浓度下,杨树菇凝集素可抑制烟草花叶病毒TMV[126];从马铃薯众提取的凝集素能够区分青枯雷尔氏菌的无毒/毒性株系,避免毒性株系被吸附到胞壁上;绣球藤凝集素能够抑制水泡口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)、牛痘病毒(vaccinia virus,CPV)和HSV[127];在土壤中,植物的种子容易被细菌侵袭,这时一些植物会在种子中释放凝集素,阻止有害细菌对根的侵染[127]。还有一些菌菇类凝集素也可抑制植物病毒,如卷边桩菇(Paxillusinvolutus)凝集素可抑制烟草花叶病毒的毒性[128];茶树菇凝集素和榆黄蘑凝集素均具有抑制植物病毒(TMV)侵染的作用[116,129]。然而,目前大多数凝集素抑制植物病毒的机理尚不明确,其在植物抗病毒的应用仍需要进一步探索。

4.3 植物凝集素外源表达

基于凝集素广泛的抗病毒功能,研究如何提高凝集素的产出变得十分重要。因此,研究人员期望通过基因克隆和外源表达系统,开发出低成本、高表达、易储存的重组凝集素,并简化凝集素的纯化过程,确保产品的安全性。尤其是GRFT,因为其低生物毒性和广泛的抗病毒能力,已经在多种外源表达系统中被尝试。如基于pET表达载体的大肠杆菌表达系统[130];基于烟草花叶病毒载体的烟草瞬时表达系统[80,131-133];烟草叶绿体表达系统[134];水稻胚乳表达系统[135]等,其中,在植物中表达的凝集素被检测具有更强的抗病毒活性,且没有生物毒性[80]。同样被外源表达的凝集素还有CV-N、GNA、豌豆凝集素(pea lectin),包括细菌、酵母及烟草等转基因植物[80,136-137]。到目前为止,水稻、玉米、烟草、大豆、油菜、甘薯、和葡萄等多种植物成功获得了转GNA基因的植株。从这些植株中提取纯化的凝集素可以极大地降低抗病毒药剂的生产成本,对人类抗病毒研究具有十分重要的意义。

5 小结与展望

凝集素高效广谱的抗病毒作用,源于其能特异结合不同的碳水化合物,不仅可结合病毒上的糖蛋白,也可结合靶细胞上的病毒受体。同时,机体免疫系统可通过响应凝集素从而对病毒进行应激反应,产生相应的抗体以清除病毒。值得注意的是,一些凝集素具有细胞毒性和促进有丝分裂性,若在人体中使用,可能会导致严重的不良反应。大多数凝集素不是单特异性的,实际上可识别几种不同的糖类型,因此,那些在正常人类细胞表面发现的识别聚糖有可能会引发脱靶毒性[21]。此外,凝集素还可刺激T淋巴细胞增殖分化产生T细胞。其中,效应T细胞可分泌出大量细胞因子杀伤病毒;而细胞毒T细胞可直接杀伤病毒。截止到目前为止,已经发现了近千种的凝集素,随着对凝集素的不断的研究探索,逐渐探明这些凝集素的蛋白质结构和功能、生物学特性及基因编码顺序等信息[138]。通过持续对这些凝集素功能进行探索与研究,结合基因编辑技术、植物生物反应器及纳米技术等将对凝集素在生物学、医学和农业领域的应用具有重大意义。

5.1 通过基因编辑技术优化凝集素抗病毒功能

许多凝集素在抗病毒过程中同时具有细胞毒性和促进有丝分裂性,在动物或人体中使用具有一定的副作用。有研究表明,香蕉凝集素的突变体H84T不仅提高了其在体内的抗病毒活性,同时也去除了其有丝分裂原性[53]。这表明通过基因编辑技术不仅可有效地降低抗病毒凝集素的副作用,同时也具有提高其抗病毒活性的潜力。并且这一活性可在外源表达系统中被保留,极大地扩宽了凝集素在生物医学中的应用范围;通过基因编辑技术还有望提高凝集素体外纯化后的稳定性,对抗动物病毒的研究具有十分重要的意义。

5.2 通过纳米技术拓宽凝集素应用范围

凝集素不仅具有一定的抗病毒功能,同时被发现具有广泛的抗真菌活性、抗虫活性和抗肿瘤活性[139-141]。然而,其在抗虫应用与抗肿瘤治疗上还没有得到广泛应用,主要原因有:一、许多凝集素具有一定的生物毒性;二、凝集素不易受消化酶的影响,但很容易被热分解;三、凝集素对碳水化合物强力的结合活性可能会导致其优先作用在其他位点,无法与靶位点结合。纳米技术是近年来一项热门的交叉性综合学科,其在生物学和药物学具有重大突破。将纳米技术运用到凝集素抗病毒、抗虫及抗肿瘤治疗策略中,有望做到精准的靶向治疗,同时也可使纯化后的凝集素更易保存和使用,是拓宽凝集素广泛应用的关键策略之一。