连翘叶速溶茶制备及多种功能成分分析*
2023-10-19赵庆生常森林
李 敬 尤 颖, 赵庆生 李 航 常森林
（1. 河北经贸大学 石家庄 050061；2. 中国科学院过程工程研究所 北京 100190）
连翘（Forsythia suspensa）为木犀科连翘属植物，具有清热解毒、消肿散结，疏散风热等多种药用功效（孙建瑞等，2017）。如，“连花清瘟胶囊”中含有连翘果，研究表明，连翘果中的连翘苷通过抑制核因子kappaB 信号通路的激活，有效抑制新型冠状病毒的复制（Wanget al. 2021），对新冠肺炎有良好的治疗效果，如，“连花清瘟胶囊”中含有连翘果。《中华本草》中记载，连翘叶“性寒，主治心肺积热”（国家中药管理局编委会, 1999），连翘叶中也含有连翘苷、连翘酯苷A、连翘脂素等多种化学成分，并且连翘苷、连翘酯苷的含量远高于连翘果中的含量（范毅等，2015; 张旭等，2021）。
连翘具有保持水土的生态功能，在我国山西、河南、河北等地广泛种植，仅在山西安泽县的天然连翘林总面积达10 万 hm2，每年秋季有大量落叶， 造成资源浪费 (龙沈飞等, 2019；任子蓓等，2016)。若能对连翘叶中功能成分进行系统分析，并且开发以连翘叶为原料的食品， 不仅可以提高连翘的经济效益, 保护自然资源, 也可使主要分布在华北地区的连翘林得以保护， 并为农民增收、乡村振兴做贡献。2017 年，山西省颁布了《食品安全地方标准 连翘叶》，将连翘叶列入食品范畴（山西省食品安全地方标准审评委员会,2017），为连翘叶及其提取物产品开发奠定了基础。速溶茶粉是一种携带方便、冲泡简单、深受年轻消费者的喜爱的新型饮料，并且有效成分容易被人体吸收（Srivastav, 2012；罗龙新, 2019）。目前已开发的有黑果枸杞（Lycium ruthenicum）速溶粉、桑叶速溶茶粉，研究数据表明均保持较高的功能成分（杨冬彦, 2018a；2019；冯晓新, 2021），关于连翘叶速溶茶的研究未见报道。
本文以不同处理的连翘叶为原料，研究连翘叶速溶茶的制备工艺，并对制备的连翘叶速溶茶进行感官评价及成分分析，以期为连翘叶速溶茶的工业化生产提供工艺参数，为连翘叶资源的综合开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验材料 3 种连翘叶（阴干连翘叶、炒制杀青的连翘叶、杀青发酵的连翘叶），源自山西省临汾安泽县。
1.1.2 试剂 连翘苷、连翘酯苷A、连翘脂素、槲皮素标准品（纯度均>98%）均购自成都德思特生物技术有限公司；没食子酸采购自北京市兴津化工厂；三氯甲烷采购自天津市福晨化学试剂厂；高效液相色谱仪所用试剂为色谱纯；其余均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；水为蒸馏水和超纯水。
1.2 试验方法
1.2.1 连翘叶提取工艺试验 以杀青发酵的连翘叶速溶茶得率为响应值，分析料液比、浸提时间、温度、提取次数对连翘叶速溶茶得率的影响，通过试验确定提取次数为2 次，采用Design-Expert 8.0.软件进行响应面试验设计，以优化试验条件。因素水平设计见表1（Raymond， 2008）。
表1 因素水平设计Tab. 1 Factors and levels of orthogonal test
1.2.2 干燥方法对连翘叶速溶茶的影响 分别用热风干燥、冷冻干燥和喷雾干燥对连翘叶水提物进行干燥，制备连翘叶速溶茶（杨冬彦， 2018b）。
1.2.3 理化性质测定 溶解时间参照果香型固体饮料标准参照(QB/T 3623—1999）；稳定性、堆积密度、吸湿率测定参照杨冬彦（2018b)的方法。
1.2.4 感官评价 根据固体饮料标准GB/T 29602—2013（国家标准化管理委员会, 2013），对连翘叶速溶茶进行感官评价。其中，色泽20 分，组织形态30 分，滋味30 分，气味20 分，共计100 分。由10 名人员对连翘叶速溶茶进行评分，结果取平均值。
1.2.5 污染物砷、铅含量测定 分别参照《食品中总砷和无机砷的测定》（GB 5009.11—2014）（中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，2014）和《食品中铅的测定》（GB 5009.12—2017）（中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，2017）分别测定砷含量、铅含量。
1.2.6 成分测定 水分和灰分含量测定参照《固体饮料标准》（GB/T 29602—2013）（国家标准化管理委员会, 2013）；蛋白质含量测定使用考马斯亮蓝法（曲春香, 2006）；黄酮含量测定使用紫外分光光度法；采用苯酚-硫酸法测定总糖含量（吕建平, 2014）；连翘苷、连翘酯苷A（孙建瑞, 2017）和连翘脂素含量测定采用液相色谱法（梅建凤, 2016）。
1.2.7 膜分离提取速溶茶多糖 通过1.2.2 选定干燥方式制得3 种速溶茶粉：阴干连翘叶速溶茶粉（FSLD）, 炒制杀青连翘叶速溶茶粉（FSL-G）和杀青发酵连翘叶速溶茶粉（FSL-B）。取连翘叶速溶茶FSL-D、FSL-G、FSL-B 各20 g， 加200 mL 蒸馏水溶解，按照1∶4 的比例加入800 mL 的4 ℃预冷乙醇，静置2 h，离心。将沉淀物进行冷冻干燥，48 h 后得粗多糖（FSLDP，FSL-GP，FSL-BP）；采用Sevag 法对粗多糖进行纯化（Burns, 2020）对粗多糖进行纯化；随后用超滤膜对连翘叶多糖进行分离，得到不同分子量分布范围的多糖，分别命名为FSL-BP<1 kDa、3 kDa
1.2.8 多糖抗氧化活性及红外表征 DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）自由基清除试验、ABTS（（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid））自由基清除试验参照Garzon（2009）。红外光谱（Infrared Spectrum，FT-IR）利用傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet iS50）进行检测。
1.3 数据分析
所有试验至少重复3 次，数据统计采用SPSS20.0进行处理。数据结果以平均值±标准偏差的方式展示，显著水平为P<0.05；绘图采用Origin8.0、EXCEL 软件。
2 结果与分析
2.1 连翘叶速溶茶制备工艺优化
2.1.1 连翘叶速溶茶提取工艺单因素优化 料液比、提取时间、提取次数、提取温度对连翘叶速溶茶得率的影响见图1。连翘叶速溶茶得率随着料液比、提取时间、提取次数都有先上升后下降的趋势，提取温度对连翘叶速溶茶得率影响较大。较优提取条件为料液比为1∶20 g·mL-1、提取时间150 min、温度80 ℃、提取次数2 次。
图1 料液比（a）、提取时间（b）、提取次数（c）、提取温度（d）对连翘叶速溶茶得率的影响Fig. 1 Effects of solid-liquid ratio (a), extraction time (b), extraction times (c) and extraction temperature (d) on yield of Forsythia suspensa leaf instant tea
2.1.2 连翘叶速溶茶提取工艺响应面优化 以连翘叶速溶茶得率为响应值，根据表1 的数据，由Design-Expert 8.0 软件得到连翘叶速溶茶得率的预测模型：响应面试验结果见表2。该模型回归显著（P<0.01），方程拟合良好。通过方差分析和回归模型响应面分析图（图2）可知，一次项C 因素对结果有显著影响；二次项A2、交互项BC 对试验结果影响极显著，二次项B2对试验结果影响显著。
图2 各因素对连翘叶速溶茶得粉率的交互影响Fig. 2 Response surface showing the interaction of various factors on the yield of Forsythia suspensa leaf instant tea powder
表2 响应面试验结果Tab. 2 2Experimental results for orthogonal test analysis
通过响应曲面优化，较佳工艺参数为：料液比1∶20.14 g/mL，提取温度90 ℃，提取时间180 min，预测为15.876 1%。在最佳工艺条件下进行验证试验，结果分别为15.16%、15.32%、15.40%，平均速溶茶得率为15.30%，与理论值相比其相对误差约为0.576%。
2.1.3 连翘叶速溶茶干燥方式研究 由图3 可知，干燥方式对连翘苷和连翘脂素的影响较大，喷雾干燥得到的连翘苷和连翘脂素含量分别为4.85%和0.11%，均高于热风干燥、冷冻干燥所得连翘苷和连翘脂素含量。这可能是由于喷雾干燥的干燥时间短，对功能成分的损失比较小。干燥方式对连翘酯苷A 的含量基本无影响。
图3 不同干燥方式对连翘叶水提物中连翘苷、连翘酯苷A、连翘脂素的含量影响Fig. 3 Effects of different drying methods on the contents of phillyrin, forsythioside A and phillygenin in water extract of Forsythia suspensae leaves
2.2 原料选择对连翘叶速溶茶品质的影响
2.2.1 溶解时间 FSL-D、FSL-G、FSL-B 平均溶解时间分别为50.04 、55.19 和46.46 s，均小于60 s，其中FSL-B 的溶解性较好。
2.2.2 堆积密度 FSL-B 的堆积密度为0.43g·mL-1，低于FSL-D 和FSL-G 的堆积密度0.54 g·mL-1和0.47 g·mL-1，表明在一定体积下，FSL-B 的质量较轻。
2.2.3 稳定性 FSL-D、FSL-G、FSL-B 的K 值平均值分别为0.006、0.039 及0.003，均小于0.05，表明3 种连翘叶速溶茶的冲调稳定性均较好，无显著差别。
2.2.4 吸湿率 3 种连翘叶速溶茶的吸湿率如图4 所示。在室温条件下，在0~30 h 内，3 种速溶茶的吸湿率增长较快，随后增加较缓慢，在150 h 时逐渐达到平衡，此时FSL-D、FSL-G 和FSL-B 的吸湿率分别为21.27%、20.33%和16.78%，其中FSL-B 的引湿性相对较弱，更易于保存。
图4 3 种连翘叶速溶茶在RH 为 80%±2%下的吸湿百分率Fig. 4 Hygroscopic percentage of three kinds of Forsythia suspensa leaf instant tea powder at 80%±2% Rh
2.2.5 速溶茶感官评价 收集得到连翘叶速溶茶的感官评分，根据样品模糊关系矩阵式，3 种速溶茶均为一等品。其中FSL-B 的滋味、气味优于其他2 种连翘叶速溶茶，感官指标得分较高，这可能与发酵过程中生成的特殊香气和滋味有关（蔡丽, 2020）。
2.2.6 速溶茶污染物砷、铅含量分析 FSL-D、FSLG 和FSL-B 的砷含量分别为0.007 4、0.006 6 和0.006 9 mg·kg-1，铅含量分别为0.327 9、0.300 4 和0.325 7 mg·kg-1，符合国家食品安全标准GB 2762—2017 食品中污染物限量指标，固体饮料中砷含量<0.5 mg·kg-1、铅含量≤1.0 mg·kg-1。
2.2.7 速溶茶功能成分分析 速溶茶的功能成分分析如表3 所示。3 种连翘叶速溶茶的水分和灰分含量均符合固体饮料标准（国家轻工业局，1999），蛋白质含量均在11%以上，总酚含量为3.22%以上，总黄酮含量为4.44%以上，总糖含量为47.76%以上。3 种连翘叶茶中的连翘苷（C27H34O11）含量分别为3.69%（FSL-D）、3.33%（FSL-G）、3.82%（FSL-B）；在连翘酯苷A（C29H36O15）的含量方面，FSL-G 中含量较高，为19.96%， FSL-D、FSL-B 中分别为14.76%和15.50%。
表3 3 种连翘叶速溶茶成分含量表Tab. 3 Composition content table of three kinds of Forsythia suspensa leaf instant tea powder
2.2.8 速溶茶粗多糖 由表4 可知， FSL-B 中粗多糖含量较高，为26.22%，经脱蛋白纯化后，FSL-DP-D、FSL-GP-D、 FSL-BP-D 的多糖含量分别为25.09%、30.64%和31.36%，比纯化前的多糖含量分别提高了28.40%、26.14%及19.60%。
表4 连翘叶速溶茶多糖得率及含量Tab. 4 4yield and content of crude polysaccharide of three kinds of Forsythia suspensa leaf instant tea powder
2.3 分子量对FSL-BP-D 多糖的影响
2.3.1 自由基清除能力测试 采用超滤膜分离不同分子量的多糖，并进行抗氧化活性分析，结果见图5。样品对ABTS 自由基的清除能力与DPPH 自由基清除能力相似，随着样品分子量的增加，样品的抗自由基清除能力越来越强。分子量大于10 kDa 多糖对DPPH自由基和对DPPH 自由基的IC50 分别为107 µg·mL-1与42 µg·mL-1，均优于未进行膜分离之前的多糖。
图5 不同分子量多糖的ABTS（A）和DPPH（B）自由基清除能力Fig. 5 ABTS(A) and DPPH(B) radicalscavenging activityof polysaccharides with different molecular weight
2.3.2 红外光谱分析 对多糖进行红外光谱分析，结果见图6。研究发现多糖的FT-IR 光谱图在4 000~500 cm-1波数内有典型的吸收峰：3 700~3 100 cm-1内的宽吸收峰为O-H 伸缩振动，1 800~1 600 cm-1为 C=O伸缩振动峰，1 430~1 290 cm-1为-C-H 弯曲振动峰，1 200~1 000 cm-1为糖类C-O 伸缩振动峰。
图6 不同分子量多糖的红外光谱图Fig. 6 Infrared spectra of polysaccharides with different molecular weights
3 讨论
3.1 连翘叶速溶茶制备工艺优化
连翘叶速溶茶制备工艺分为提取和干燥两个阶段。在提取阶段，通过单因素实验和响应曲面实验对提取条件进行优化，最佳提取条件下提取率为15.30%。优于文献报道的12.50% （李可, 2021）。与茯砖速溶茶最大出粉率17.2%较接近 （曹霞, 2021）。在干燥阶段，喷雾干燥的干燥时间短，对功能成分的损失比较小，同时，喷雾干燥成本低的优势（Srivastavet al., 2012；杨海燕, 2016），因此采用喷雾干燥来制备连翘叶速溶茶。
3.2 原料选择对连翘叶速溶茶品质的影响
采用阴干连翘叶、炒制杀青连翘叶、杀青发酵连翘叶制备得到3 种速溶茶FSL-D、FSL-G、FSL-B。稳定性、污染物含量、溶解性、稳定性分析表明，3 种速溶茶均符合国家对于固体饮料的规定。吴茂玉等（2019）报道的破壁灵芝孢子粉的堆积密度在0.4~0.65 g·mL-1之间，与本研究中速溶茶的堆积密度较接近。杀青发酵连翘叶制备得到的FSL-B 表现都更佳，其中FSL-B 的滋味、气味优于其他2 种连翘叶速溶茶，感官指标得分较高，这可能与发酵过程中生成的特殊香气和滋味有关（蔡丽，2020），具有溶解速度快、堆积密度小、吸湿率低、感官评价高、多糖含量高的特点。因此，选择杀青发酵连翘叶作为制备速溶茶的原料。
3.3 分子量对FSL-BP-D 多糖的影响
对杀青发酵连翘叶速溶茶多糖FSL-BP-D 进行超滤分级分离，制得三种分子量多糖样品FSL-BP<1 kDa、3 kDa
4 结论
研究采用响应面设计优化水提工艺，并考察干燥方式对功能成分的影响，然后利用阴干连翘叶、炒制杀青的连翘叶、杀青发酵的连翘叶为原料制备速溶茶粉，最后分析连翘叶速溶茶粉理化性质和功能成分。经响应面优化，在料液比1:20.14 g·mL-1、温度90 ℃的条件下，提取时间180 min，连翘叶速溶茶的平均得率最高。喷雾干燥更有利于连翘苷和连翘脂素等功能成分的保持。3 种连翘叶速溶茶粉冲调稳定性、吸湿性、污染物含量、总酚含量都符合行业标准，连翘苷含量在3.34%以上，连翘酯苷A 在14.76%以上，连翘脂素在0.13%以上。其中杀青发酵的连翘叶速溶茶粉具有堆积密度低、吸湿性弱的优点，并且感官评价分值高，更适宜于进一步开发研究。对其粗多糖进行分析发现，抗氧化性随着分子量增大而提高，且与O-H 伸缩振动峰、C=O 键的伸缩振动峰及-C-H 弯曲振动峰活性减弱相关。本研究采用水提工艺，无辅料添加，安全、环保、健康；同时速溶茶粉饮用方便、保质期长、健康美味，丰富了现有连翘产品种类，有望进一步开发成抗氧化等功能性产品，提高连翘种植经济效益。
