LC-AJS ESI-MS/MS同时测定果露酒中7种甜味剂、2种防腐剂和柠檬酸

孙莉，周玉，余义，刘智康，毛从兴，唐艳荣

1.黄鹤楼酒业有限公司（武汉 430050）；2.湖北信嘉检测科技有限公司（咸宁 437000）；3.黄鹤楼酒业（咸宁）有限公司（咸宁 437000）

果露酒是以醇化果加酒精、果汁、水调制而成的露酒。果露酒属于露酒。相关标准对露酒的定义，露酒是以蒸馏酒、清香型汾酒或食用酒精为酒基，以药食两用的动植物精华，按先进工艺加工而成，改变其原酒基风格的饮料酒。果露酒是以葡萄、猕猴桃或其他浆果等为原料，经分选、破碎、去梗、发酵、储酒、调配酿制成别有风味的葡萄酒、猕猴桃酒等美味酒。

随着科技的不断发展，许多企业为追求利润的最大化，以及用最短的时间生产出更多的果露酒，往往会选择通过往酒基中添加各种食品添加剂，以此达到高产的效果。而过多的添加剂被人体吸收后，人体器官如果不能及时代谢掉，如人工合成的阿斯巴甜、纽甜等，并且过多的使用食品添加剂导致身体器官代谢负担过重，长此以往将会导致身体各项机能的下降，严重危害人体健康。

针对食品添加剂的检测方法有许多，如液相色谱法、液相色谱质谱联用法、离子交换法等，试验通过液相色谱质谱联用仪对果露酒中7种甜味剂、2种防腐剂和柠檬酸进行定性和定量分析。针对目标物浓度残留的问题进行分析，尽可能完善检测方法，使方法对果露酒检测的使用性达到最佳。利用检测手段以期能更加及时有效地对果露酒产品中添加剂含量进行控制，保护消费者的身体健康作出努力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈（色谱纯，J.TBaker）；一级水（德国默克密理博有限公司）；乙酸铵、冰乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；异丙醇（色谱纯，J.TBaker有限公司）；水相滤膜（0.22 μm，天津津腾实验设备有限公司）；安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜、阿力甜、苯甲酸、山梨酸、柠檬酸标准品（纯度99.8%，上海安谱实验科技股份有限公司）。

亚铁氰化钾溶液（92 g/L）：准确称取106 g亚铁氰化钾，加入适量一级水进行超声溶解，待溶解后用水定容至1 000 mL。

乙酸锌溶液（183 g/L）：准确称取220 g乙酸锌，加入适量一级水进行超声溶解后，加入30 mL冰乙酸，充分混匀后用水定容至1 000 mL。

1.2 仪器与设备

液相色谱-三重串联四极杆质谱仪、Agilent SBC18RRHD（2.1×50 mm，1.8 μm）色谱柱（美国Agilent公司）；电子天平（万分之一，梅特勒托利多科技中国有限公司）；超声波清洗池（KQ-250E型，昆山市超声仪器有限公司）；抽滤装置（1 000 mL，天津津腾实验设备有限公司）；0.22 μm水相滤膜（天津津腾实验设备有限公司）。

1.3 方法原理

对市购果酒和露酒进行感官分析，对于澄清透明的样品，采用加水稀释，超声混匀方式进行前处理；对于浑浊度较高的样品，采用加入亚铁氰化钾和乙酸锌溶液进行沉淀，取上清液过0.22 μm滤膜上机检测。前处理后的样品进入液相色谱进行分离，经质谱检测器进行定性、定量分析，试验方法均采用外标法对样品进行含量测定。

1.4 试验方法

1.4.1 流动相的配制

流动相A（0.1%乙酸-5 mmol/L乙酸铵溶液）：取1 mL乙酸（分析纯）和0.39 g乙酸铵（分析纯）加入1 000 mL一级水，经过0.22 μm水相滤膜抽滤，超声混匀除去CO2，超声时间不宜过长，避免流动相基质变化，影响色谱峰分离效果。

流动相B（甲醇）：色谱纯，为避免抽滤过程中溶入其他杂质，只需超声除去CO2即可。

1.4.2 标准储备溶液

安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜、阿力甜标准储备液（100 mg/L）：准确称取0.01 g标准品于6个100 mL容量瓶中，用一级水溶解并定容至刻度，充分混匀，放置于2～4 ℃冰箱冷藏储存。

苯甲酸、山梨酸标准储备液（500 mg/L）：准确称取0.05 g标准品于2个100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，充分混匀，放置于2～4 ℃冰箱冷藏储存。

柠檬酸标准储备液（1 000 mg/L）：准确称取0.1 g标准品于100 mL容量瓶中，用一级水溶解并定容至刻度，充分混匀，放置于2～4 ℃冰箱冷藏储存。

1.4.3 标准曲线溶液配制

混合标准溶液：分别吸取一定体积的上述标准储备液于10 mL容量瓶中用一级水定容，混匀后得安赛蜜10.00 mg/L、糖精钠10.00 mg/L、甜蜜素10.00 mg/L、三氯蔗糖20.00 mg/L、阿斯巴甜10.0 mg/L、纽甜10.0 mg/L、苯甲酸25.0 mg/L、山梨酸25 mg/L和柠檬酸50 mg/L混合标准溶液，于2～4 ℃冰箱冷藏储存。

混合标准工作液：分别移取适量体积的混合标准溶液，用一级水配制成混合标准工作液，现配现用。

1.4.4 仪器条件

1.4.4.1 色谱条件

Agilent SB-C18RRHD（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）色谱柱，流动相A为0.1%乙酸-5 mmol/L乙酸铵，流动相B为甲醇（梯度洗脱，见表1），流速0.3 mL/min，柱温40 ℃，进样量2 μL。

表1 梯度洗脱程序表

1.4.4.2 质谱条件

带有鞘气的电喷雾离子源，正/负离子模式，带铂镍涂层的导电毛细管，多反应监测（MRM）模式，电子倍增电压正模式200 V，负模式200 V，离子源温度325 ℃，雾化气流速8 L/min，气帘气压30 psi，鞘气温度350 ℃，鞘气流速12 L/min，喷嘴电压正模式300 V，负模式500 V，电喷雾电压正模式3 500 V，负模式3 000 V，按此条件对10种食品添加剂的离子对进行摸索分析，确定目标化合物的离子对条件，见表2。

表2 10种食品添加剂的MRM参数

1.4.5 样品的制备

称取2 g酒样于50 mL离心管中，对于澄清透明的样品，加水稀释至25 mL，超声混匀后，取上清液过0.22 μm滤膜上机检测；对于浑浊度较高的样品，称取2 g酒样于50 mL离心管中，加水稀释至25 mL，加入2 mL亚铁氰化钾（92 g/L）和2 mL乙酸锌（183 g/L）溶液进行沉淀，置于5 000 r/min离心机中离心5 min，取上清液过0.22 μm滤膜上机检测。

1.4.6 空白试验

按照样品制备步骤不加样品，进行处理后上机检测。

1.5 结果计算

样品中10种食品添加剂的含量按（1）计算。

式中：X为样品中10种食品添加剂含量，g/kg；c为测定溶液中10种食品添加剂含量，μg/L；c0为测定空白溶液中10种食品添加剂含量，μg/L；V为样液的最终定容体积，mL；m为取样量，g；f为样品的稀释倍数；1 000×1 000为μg/L转换为g/kg的换算因子。

2 结果与分析

2.1 色谱条件和质谱条件的优化

2.1.1 色谱条件的优化

通过对10种食品添加剂物理和化学信息的分析，分别以0.1%乙酸-甲醇、5 mmol/L乙酸铵-甲醇、0.1%乙酸+5 mmol/L乙酸铵-甲醇作为流动相进行样品分离。由于不同流动相的pH不同，对色谱柱中的填料物质会起到一定作用，有的流动相有利于目标物质的分离，有的流动相则会抑制目标物出峰，导致峰形异常，如峰拖尾、峰前伸、双头峰及鬼峰等现象，甚至于不出峰，均不利于对样品进行定性及定量分析。通过利用上述流动相对10种添加剂进行色谱峰分离，准备好单标物质，将准备好的单标物质进入色谱柱查看出峰效果，需保证保留时间、峰形、响应均良好且分离效果好，灵敏度和响应合适。结果表明，用0.1%乙酸+5 mmol/L乙酸铵-甲醇作为流动相时，物质分离度、峰形、响应值及保留时间的稳定性均优于其他流动相，故选用0.1%乙酸+5 mmol/L乙酸铵-甲醇为流动相进行洗脱。见图1。

图1 10种食品添加剂混合标准溶液的总离子流色谱图

10种添加剂的出峰时间依次为：0.996 min，安赛蜜；1.500 min，阿力甜；2.045 min，糖精钠蜜；3.000 min，甜蜜素；4.522 min，三氯蔗糖；4.846 min，阿斯巴甜；5.000 min，苯甲酸；5.100 min，山梨酸；6.460 min，纽甜；11.500 min，柠檬酸。

2.1.2 质谱条件的优化

将单标纯品目标物标准溶液不经过色谱柱注入质谱，分别进行正、负离子模式，在Scan状态下进行全扫描检测，得到TIC总离子流图，根据总离子流图标记出特征离子峰，进行SIM模式扫描，将标记出的准分子离子峰进行单独扫描，得到EIC提取离子流图。用碰撞气惰性气体高纯氮气攻击该前体离子，获得其二级质谱图及相应的子离子。由于试验方法是同时分析10种目标物质，且各物质间质荷比差异较大，所以在进行电离模式选择时发现有的目标物在正离子模式下灵敏度及响应比负离子模式更高，而有的目标物则恰恰相反，所以试验方法中既有正离子模式也有负离子模式的存在，但2种模式同时存在则对电离毛细管的要求较高，需使用带有铂镍涂层的导电毛细管，才能在短时间内完成正负模式的快速切换。利用多反应监测模式（MRM）对选定的定性离子和定量离子对裂解电压、毛细管电压、碰撞能、保留时间、碰撞池加速电压等质谱参数进行优化，使各监测离子丰度和信号达到最佳。

通过设置Precursor Ion模式对母离子进行确认，通过设置Product Ion模式下，利用碰撞池电压对母离子进行轰击，得到相应的子离子碎片，选择其中离子丰度高的离子作为子离子，且每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括1个母离子和2个子离子，试验方法通过设置均能确定10种添加剂的母离子和2个子离子。

经过质谱条件设置，确定试验方法采用正、负离子模式采集，该模式下的质谱分析参数见表2。

2.2 标准曲线、线性范围和方法检出限、定量限

将配制好的混合标准工作液按优化好的仪器条件上机进行测定，以目标组分色谱峰面积对相应的标准溶液质量浓度进行线性回归分析，得到各自的线性回归方程和相关系数。参考GB/T 27417—2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》中检出限和定量限的评定方法，采用信噪比法评估检出限和定量限，检出限可接受的信噪比≥3∶1，定量限可接受的信噪比≥10∶1。为保证方法的实用性，选择将10种添加剂分别加入果露酒酒基中（蒸馏酒、清香型白酒或食用酒精），模拟10种添加剂在酒基中的状态，选择食用酒精为基质，在食用酒精样品中添加10种添加剂的标准储备液，进行方法检出限和定量限的探底试验。在保证信噪比满足相关标准使用要求的前提下，也要保证峰形的完整，且峰形无异常，通过对方法的优化确保基质对方法检测结果影响最小。分别对各目标化合物线性范围的最低浓度点进行信噪比分析，结果见表3。

表3 10种食品添加剂的线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.3 回收率和精密度

市面上果酒和露酒品种繁多，比较有代表性的是鸡尾酒、葡萄酒、各种花酿的酒，故选取鸡尾酒、葡萄酒和玫瑰花酒3种果露酒进行加标回收试验。在称取好的样品中准确加入一定量的10种食品添加剂混合标准溶液，配制成低、中、高3个不同添加水平，按上述试验方法前处理，平行测定6次，扣除样品本底含量后计算结果见表4。

表4 果露酒中10种食品添加剂的加标回收率和精密度（n=6）

经检测，所选取的样品中鸡尾酒、葡萄酒和玫瑰花酒中山梨酸、苯甲酸和柠檬酸各自有检出，本底值在1.10×10-3～3.20×10-3g/kg之间，其他7种甜味剂均未检出。扣除样品本底值后计算结果表明，各目标化合物平均加标回收率在88.4%～110%之间，相对标准偏差为1.2%～7.6%，方法的准确度和精密度均符合食品中添加剂残留量分析的要求。

3 结论

建立液相色谱-质谱串联技术检测方法，使用AJS ESI离子源同时测定果露酒中7种甜味剂、2种防腐剂和柠檬酸含量的方法，并对该方法进行了优化处理。从多方面保证方法对于果露酒检测的准确性和适用性，最大限度降低基质效应对于检测结果的影响。为验证方法的实用性，参考相关方法验证学标准，从多角度、多维度对试验方法进行方法学验证，保证方法的完整性和全面性。试验方法前处理简单易操作，有效去除蛋白和色素问题，检测灵敏度高，适合对果露酒中10种添加剂进行大批量定性筛查和定量分析，为食品安全监测提供技术支持。